采用异步培养法于PDA平板中央接种直径5mm的病原菌菌饼.doc

实验方法 1 采用异步培养法于PDA 平板中央接种直径5mm 的病原菌菌饼, 27摄氏度 培养24 h 后在距离菌饼2cm 处接种分离的内生细菌, 27摄氏度恒温箱中培养, 同时以不接菌为对照。当对照长至培养皿边缘时, 测量抑菌圈大小。 2 拮抗测定试验采用改良的琼脂扩散法. ( 1)病原真菌在PDA 平板上培养2- 5 d, 用无菌水冲洗菌苔配成孢子悬浮液, 吸取1mL制备好的孢子悬浮液, 加入到熔化并冷却到45 摄氏度 左右的6 mL PDA 培养基(琼脂含为0. 9% )中, 混匀后倾覆在已凝固的PDA 平板上, 待上层培养基冷却凝固后, 在平板上打孔(直径为6mm) , 在每个孔内加内生菌发酵液40 LL, 将平板置于25摄氏度 培养2- 4 d后观察抑菌情况及抑菌圈大小. ( 2)病原细菌在NA 培养液中发酵培养至对数生长期; 吸取制备好的发酵液1mL, 加入到熔化并冷却到45摄氏度 左右的6mL NA 培养基(琼脂含量为0. 9% )中, 混匀后倾覆在已凝固的NA 平板上, 待上层培养基冷却凝固后, 在平板上打孔(直径为6 mm) , 在每个孔内加内生菌发酵液40 LL, 将平板置于25摄氏度培养1- 2 d后观察抑菌情况及抑菌圈大小. 上述每处理均设3个重复, 以无菌水为对照 3 拮抗菌活性测定采用对峙培养法。在超净工作台上进行无菌操作：将直径6mm 的供试病原真菌的菌块接种于PDA 培养基的培养皿中央，再用直径6mm的打孔器在生长7d 左右的内生真菌菌落边缘制备菌饼，并接种于PDA 平板上距中心2cm 处同一直线的两点上，对照不接筛选菌，28℃下培养72h，测量各筛选菌菌落边缘和病原菌菌落边缘之间的抑菌距离，选择拮抗作用明显的菌进行复筛或鉴定[7-9]。该试验重复2 次，每次设3 个重复 4 拮抗病原真菌测定: 在直径为9c m 的PD A 平板中央接人一直径为8m m 的病原 真菌菌块, 同时在平板边缘接人一小环待测细菌菌落(28 ℃ 下, 海水N A 上培养24 h ),27 ℃ 下黑暗培养5 一7 d, 每菌株至少重复3 次, 分别测量抑菌半径大小. 5 在培养皿中加入10 mL ( 45℃) 左右的NA 培养基, 凝固后, 取培养2 d 稀释10 倍的茄青枯病菌菌液1 mL, 移到已制好的N A 平板上, 用无菌三角玻棒涂匀, 然后在每个皿的中央用直径为5 mm 的打孔器打孔, 在孔中注入已稀释10 倍在NA 培养液中培养2 d 的分离菌液50 uL, 以注入NA 培养液的为对照, 每个处理3 次重复, 于28～30℃下培养, 2 d 后观察测量抑菌圈的直径。 6 将分离得到的菌株纯化后, 采用平板对峙培养法, 用金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、荧光假单胞菌、扩展青霉作初步拮抗测定, 筛选出对4种指示菌均有拮抗作用的内生细菌, 于液体 培养基中摇床培养。将发酵液在10 000g条件下离心15m in, 将上清液过0. 45．m 无菌滤膜后采用管碟法测定抑菌活性, 所有试验设3个重复。