植物生理学实验-7.docxVIP

刖产/步 本科实验报告 姓名：钱嘉曙 学院：环境与资源学院 专业：农业资源与环境 学号：3180100470指导教师：周启发老师 2019年 12月4日 刖户/货实验报告 课程名称： 植物生理学及实验 实验类型:探索、综合或验证实验工程名称：植物组织中可溶性蛋白和MDA的测定 学生姓名：钱嘉曙专业:农业资源与环境 学号:3180100470同组学生姓名：林姝 指导老师：周启发老师实验地点：生物学实验中心313 琴 实验日期：2019年H月27日，12月4日订 ———— 线一、实验目的和要求 .掌握植物组织中蛋白和丙二醛(MDA, malonyldialdehyde) 提取。 .掌握用比色法测定组织粗提液蛋白质和MDA. .掌握植物组织中超氧物岐化酶(SOD)活性测定方法；. 了解植物衰老的原理。 二、实验内容和原理 衰老是指细胞、器官或整个植株生理功能自然衰退，最终 导致死亡的过程。衰老时生理生化变化主要有：蛋白质含量下 降，生物膜降解，核酸含量的变化，光合速率下降，呼吸速率 下降，植物内源激素的变化等。 植物叶片衰老过程中，叶绿素含量下降，叶色变黄，蛋白 质含量减少(可溶性蛋白)。自由基代谢失调，并在体内积累膜 脂过氧化的产物之一：MDAo(1)可溶性蛋白测定的原理 考马斯亮蓝G-250与蛋白质结合后，溶液的吸收光谱发生 变化，从465nm偏转到595nm,并表现出在595nm处的吸 收值与溶液中的蛋白质含量有线性关系，其范围从 01000g/mlo据此可制作蛋白质的标准曲线，牛血清蛋白 为常用的标准蛋白。 待测样品经缓冲液提取后，可溶性蛋白溶于上清液中，蛋 白质提取液与考马斯亮蓝G-250反响呈蓝色。测定595nm 吸收值，并根据蛋白质的标准曲线，得到样品中可溶性蛋 白的含量。 (2) MDA测定原理 MDA在高温、酸性条件下与硫代巴比妥酸(TBA)反响，形成 粉红色复合物(3, 5, 5—三甲基嗯嗖2, 4-二酮)，该复合 物在532nm处有最大吸收峰；600nm处是最小吸收峰，两 峰差值的消光系数为155 (mM)H cm1(3)超氧物岐化酶(SOD)活性测定原理： _SOD 2。2 + 2H2。—“Hz。? +。2 四氮嗖蓝(NBT)光照还原的分光光度法:核黄素受光照产生 的「能将NBT还原为蓝色的甲腺，甲腺在560nm波长有最 大吸收，而SOD能清除。2一,抑制甲腺的产生使吸收减小。 通过分光光度检测SOD对-的抑制率，可以表征出SOD含 量。 三、主要仪器设备准备材料：叶龄差异明显的叶片假设干 仪器：离心机、天平、制冰机、分光光度计，研钵、移液枪、移 液管、离心管等。 四、操作方法与实验步骤 (一)可溶性蛋白测定(1)制备蛋白提取液 称叶龄差异明显的叶片各0.50g，加入5nli磷酸缓冲液(50mmol, pH值为7. 8),于冰浴中研磨提取，匀浆液以8000g离心力作用下(4℃) 离心lOmin,其上清液即为蛋白提取液。 (2) 0 - lOOug/ml蛋白标准曲线的制作(3)显色反响(样品的测定)： 取40ul蛋白提取液+160U 1磷酸缓冲液于玻璃试管中，加入 4. 8ml考马斯亮蓝溶液，混匀后放置2min,用lOnrni厚的比色杯在 595nm下比色读取0D值。对照为空白的磷酸缓冲液加上4. 8ml考马 斯亮蓝溶液。 （二）MDA测定 取上清液1.0ml于7ml离心管中，加TBA与TCA混合液4.0ml,然 后在离心管盖上戳一小孔，92°C水浴保温30min空白管：1mL Pi-buffer +TBA 与 TCA 混合液 4. 0ml （92℃ 水浴 30min）冷却后，平衡，离心5min； lOOOOrpm测定 A532, A450 和 A600。 （三）超氧物岐化酶（SOD）活性测定 称叶龄差异明显的叶片各0.5g，加入5ml磷酸缓冲液（50nimol, pH值为7.8）,于冰浴中研磨提取，匀浆液以10000g离心力作用下 （4℃）离心10min,其上清液即为酶提取液。 在暗光条件下加入3mL NBT反响液 和100 D L酶提取液于试管中， 25℃照光（4000T00001ux）并计时,6-25min后出现颜色变化，9min 后测560nll10D值。同时作空白实验。 根据SOD抑制NBT光化学还原的量计算SOD酶活性（unit/gFW）。 一个酶活单位相当于引起31nL NBT反响液到达50%抑制所需要的酶 量。测定时用未照光NBT反响液调零。 五、实验数据记录和处理（一）可溶性蛋白测定 标准曲线： y = 164. 08x - 3. 6176R2 = 0. 9956 值OD 值OD §)螂和 VSCQ显色反响: §)螂和 VSCQ 叶片种类0D值新叶 0. 823 老叶0. 152新叶