第二章产酶微生物的分离与筛选.ppt

Chapter 2 Isolation and Purification of Microorganisms Producing Enzyme;酶的生产方法;Contents of chapter 2;2.1 常见产酶微生物;(1) 大肠埃希氏杆菌，简称为大肠杆菌，是最为著名的原核生物。;(2) 醋酸杆菌（Acetobacter） ;(3)枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis） ;(4) 根霉(Rhizopus) ;(6)曲霉(Aspergillus) ;菌种选育;2.2.1 样品的采集;2.2.2 富集培养;2.2.3 分离;1. 胞外酶的产酶菌株的筛选方法 2. 胞内酶的产酶菌株的筛选方法 如果是胞内酶，则可采用以下两种方法来确定： (1) 固体培养法 把菌种接入固体培养基中，保温数天，用水或缓冲液浸泡培养基，将酶抽提，测定酶活力，这种方法主要适用于霉菌； (2) 液体培养法 将菌种接入液体培养基后，静置或在摇床上振荡培养一段时间(视菌种而异)，再测定培养物中酶的活力，通过比较，筛选出产酶性能较高的菌种供复筛使用。;2.2.4 初筛;2.3 产酶微生物优良菌种的选育;2??诱变育种方法 ;(2) 制备菌悬液;(3) 诱变处理;诱变剂及其诱发机理;a. 交联是由二聚体引起的，二聚体可以在同一条链相邻的碱基之间产生，也可以是在二条链的碱基之间形成。它会引起DNA复制错误，正常的碱基无法配对，造成错义或缺失。嘧啶比嘌呤对紫外线敏感得多。;b. 过量的紫外线照射会造成菌体丢失大段的DNA，或使交联的DNA无法打开，不能进行复制和转录，从而引起菌体死亡。;暗修复(dark repair) 作用：可修复由紫外线、γ射线和烷化剂等对DNA造成的损伤。野生型大肠杆菌细胞的切除修复系统非但可以修复自身的DNA紫外线损伤，还能修复外来的噬菌体T1及T3等的DNA所受到的紫外线损伤。;重组修复(recombination repair)：重组修复必须在DNA进行复制的情况下进行，所以又称为复制后修复。;2. 化学诱变剂;碱基类似物:有5-溴尿嘧啶(5-BU)，5-氟尿嘧啶(5- FU)、8氮鸟嘌呤(8-NG)和2-氨基嘌呤(2-AP) ;移码突变的诱变剂:吖啶类染料(原黄素、吖啶黄、 吖啶橙及α -氨基吖啶等)和称为ICR类的化合物;;突变是随机不定向的，但是筛选是定向的。筛选的条件决定选育的方向，因为突变体高产性能总是在一定的培养条件才能表现出来。在一个适于突变株繁殖的特定条件下可以筛选得到具有新性状的菌株??其他原养型菌株则逐步被淘汰。所以，培养基和培养条件是决定菌种某些特性保留或淘汰的筛子。 为了有效地筛选突变株，必须采用使新个体表型得以充分表达的筛选条件。首先要设计一个良好的筛选培养基和确定合适的培养条件。培养基无论从组成成分、浓度、配比、pH值都要有利于突变株优良性状的表现。同时，培养基和培养条件应尽量力求和大生产条件一致，才能使选育的菌株应用于工业大生产。;常规的筛选程序;2. 简便筛选程序;;2 菌种筛选的手段;碱性脂肪酶变株FS-1884变异前后的菌落形态;?平皿快速检测法;（2） 变色圈法;（3） 透明圈法;摇瓶培养法（随机筛选）;原生质体 　　　　植物或微生物细胞去掉壁以后的内含物称原生质体。 　　　　原生质休融合育种是基因重组育种的一种重要方法。; 标记菌株的筛选和稳定性验证。 原生质体制备。 等量原生质体加聚乙二醇促进融合。 涂布于再生培养基，再生出菌落。 选择性培养基上划线生长，分离验证，挑取融合子进一步试验、保藏。 生产性能筛选。