基因工程第一章 核酸的制备.pptVIP

PCR技术简史 1971年，Khorana提出：经过DNA变性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因。 但由于测序和引物合成的困难，以及70年代基因工程技术的发明使克隆基因成为可能，所以，Khorana的设想被人们遗忘了…… 第三十一页，共七十四页。 PCR技术简史 1985年，美国PE-Cetus公司的Mullis等人发明了聚合酶链反应（PCR） 基本原理是在试管中模拟细胞内的DNA复制 最初采用E-coli DNA聚合酶进行PCR，由于该酶不耐热，使这一过程耗时，费力，且易出错 耐热DNA聚合酶的应用使得PCR能高效率的进行，随后PE-Cetus公司推出了第一台PCR自动化热循环仪 1993年，Mullis等因此项技术获诺贝尔化学奖 第三十二页，共七十四页。 1. PCR的基本原理(Mechanism of PCR ) 类似于DNA的体内复制。 其原理是通过高温变性模板、引物与模板退火、引物沿模板延伸三步反应组成一个循环，通过多次循环反应，使目的DNA得以几何级数倍增。 第三十三页，共七十四页。 5? Primer 1 5? Primer 2 Cycle 2 Cycle 1 5? 5? 5? 5? 5? 5? Template DNA 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 第三十四页，共七十四页。 Cycle 3 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 25～30 次循环后，模板DNA的含量可以扩大100万倍以上。 第三十五页，共七十四页。 （3）PCR的基本反应步骤 变性 95?C 延伸 72?C 退火 Tm-5?C 第三十六页，共七十四页。 PCR反应 标准的PCR反应条件： 10X缓冲液（Buffer）10 μL 4种dNTP混合物 各200umol/L 引物（Primer） 各10～100pmol 模板DNA （Template） 0.1～2μg Taq DNA聚合酶 0.5 ～ 2.5U Mg2+ 　　　　　 1.5mmol/L 第三十七页，共七十四页。 PCR反应 第三十八页，共七十四页。 70-75℃ 90-94℃ 37-60℃ PCR循环 第三十九页，共七十四页。 1 2 3 4 5 22 55 72 94 时间（min） 温度 （℃） PCR反应 适温延伸 3 高温变性 1 低温退火 2 重复1~3步 25~30轮 目的DNA片段 扩增100万倍以上 DNA双螺旋 DNA单链 与引物复性 DNA变性 形成2条单链 子链延伸 DNA加倍 37-60 ℃ 90-95℃ 70-75 ℃ 第四十页，共七十四页。 PCR 扩增 No. of No. Amplicon Cycles Copies of Target 1 2 2 4 3 8 4 16 5 32 6 64 20 220=1,048,576 30 230=1.07X107 1 cycle = 2 Amplicon 2 cycle = 4 Amplicon 3 cycle = 8 Amplicon 4 cycle = 16 Amplicon 5 cycle = 32 Amplicon 6 cycle = 64 Amplicon 7 cycle = 128 Amplicon 第四十一页，共七十四页。 PCR反应特点 灵敏度高 皮克(pg=10-12)量级扩增到微克(ug=10-6)水平 能从100万个细胞中检出一个靶细胞 病毒检测的灵敏度可达3个RFU（空斑形成单位） 细菌检测的最小检出率为3个细菌 简便、快速 一次性加好反应液，2～4 小时完成扩增 扩增产物一般用电泳分析 对标本的纯度要求低 血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等组织的粗提DNA 第四十二页，共七十四页。 （1）Taq DNA聚合酶 （2） Pwo DNA 聚合酶 （3）Tth DNA 聚合酶 （4）C.therm 聚合酶 4.2.1 耐热性DNA聚合酶 第四十三页，共七十四页。 （1）Taq DNA聚合酶 1986年从一种75℃热泉中的细菌 (Thermus aquaricus)中分离纯化出来的。 95kDa，单分子酶， 75℃ 活性最强。 具有 5’-3’ 合成活性和 5’-3’ 外切活性 , 无 3’-5’ 外切活性。 95℃ 时半衰期为 40 分钟。 启动 PCR 反应的能力很强，聚合速度快，在 72℃ 的聚合速度为每秒 30-100 碱基。 由于没有 3-5 外切活性，在扩增过程中有 8.9-11x10 -5 的错配率。 第四十四页，共七十四页。 （2） Pwo DNA 聚合酶 来自 古细菌Pyrococcus