基因诊断与基因治疗.ppt

基因诊断与基因治疗 (Gene Diagnosis and Therapy) 基因诊断（4-18） 基因治疗（4-25）   2013年，H7N9禽流感来袭，快速而准确地对疑似患者作出诊断，能有效的增大患者的生机。 通过什么方法作出快速诊断？如何来进行治疗？ 48小时内使用最有效 利用分子生物学方法，直接检测基因结构及其表达水平是否异常，从而对疾病作出诊断,为治疗提供依据。 特点： 针对性强，特异性高 实用性强，诊断范围广 预见性，适应性 基因诊断 基因诊断常用技术方法 （一）核酸分子杂交技术 （二）聚合酶链反应 (PCR) （三）基因测序 （四）基因芯片 核酸分子杂交技术原理 Southern 印迹杂交法（Southern blotting ） Northern 印迹杂交法（Northern blotting ） 斑点杂交或狭缝杂交法（Spot/ Slot blot hybridization） 菌落杂交（colony hybridization） 夹心杂交法（sandwich hybridization） 原位杂交（ hybridization in situ） 常用固相核酸杂交方法 (1) Southern 印迹杂交法 限制性内切酶酶切 检测杂交信号 提取DNA Southern 法可用于检测特异的DNA序列片段,进行基因定位、分子量测定等。 （2）Northern 印迹杂交法 （其基本过程类似于上述Southern法） 提取RNA样本→RNA变性→琼脂糖凝胶电泳分离→转移至膜→探针（标记DNA或RNA）与之杂交→显影或显色→检测信号。 Northern法可用于检测组织细胞中总RNA或mRNA （6）原位杂交 将标记探针与细胞或组织切片中的核酸进行杂交，进而 检测特异的DNA或RNA序列。 细胞原位杂交、组织切片原位杂交 DNA-DNA、RNA-DNA、RNA-RNA 优点： 不需提取核酸，故可完整保持组织或细胞的形态，因而更能准确地反映组织细胞的功能状态。 （二）聚合酶链反应（polymerase chain reaction PCR） Kary Mullis research scientist in the 1980s at a California biotechnology company called Cetus co-winner of 1993 Nobel Prize PCR产物以指数形式增加，即Y = 2n n为循环数 （三）基因测序技术 他们给DNA 的测序带来了一场革命，分享了1980年的诺贝尔化学奖。后来Sanger法发展为自动化测序法，并为人类基因组测序做出了卓越贡献。 Fred Sanger 发明的末端合成终止法 (sanger法) Walter Gilbert发明的化学裂解法 Maxam-Gillbert法 （四）基因芯片技术 快速、高通量、平行化、自动化 基因诊断方法 经典基因诊断 .限制性内切酶法 .RFLP分析法 .寡核苷酸分析法 优点 缺点 特异基因诊断 未知基因诊断 直接，过程简单 过程繁杂 准确性低，过程繁 条件严格 基因诊断进展 .PCR方法 .PCR-序列分析法 .DNA芯片技术 简单、经济、敏感 操作直接、准确 集成度高、快速、并行 假阳性高 价格高 尚无成熟产品问世 四. 基因诊断的临床应用 遗传疾病 肿瘤 感染性疾病，传染性流行病 判断个体疾病易感性 器官移植组织配型 法医学中个体识别、亲子鉴定 镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析 实时荧光定量PCR技术 (Real time Quantitative PCR) 实时监测 荧光 起始模板 Real Time vs. Traditional PCRPCR PCR分四个阶段 Ct value Baseline Threshold 荧光定量PCR原理－－Ct值定量的数学原理 非理想的PCR反应 Xn＝X0 （1＋En）n * Xn：第n次循环后扩增产物数量 X0