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[说明]primer5 中文使用说明 Primer Premier 4.10 Primer Premier4.0 是由加拿大的 Premier 公司开发的专业用于 PCR 或测序引 物以及杂交探针的设计，评估的软件，和 Plasmid Premier2.02 一起是该公司推出 的最新的软件产品。其主要界面同样也是分为序列编辑窗口(Genetank)，引物设计 窗口(Primer Design)，酶切分析窗口(Restriction Sites)和纹基分析窗口 (Motif)。这里我们主要介绍其引物设计功能，其他功能的介绍请参看Plasmid Premier2.02。 打开程序首先进入的是序列编辑参看，与 Plasmid Premier 相比，其多了一个 语音校正的功能，即在输入序列的时候，程序自动将碱基读出，以便用户进行校 正，保证输入的正确和快速。 点击该界面的按钮即可进入到程序的引物设计窗口。 该界面共分为四层，最上面一层左面是 5 个控制按钮，用于实现引物设计中的 各种功能，包括引物自动寻找，寻找结果查看和引物编辑;右边是观察两个引物在 模板上结合位置的直观图以及对正链还是负链引物进行选择;第二层是显示模板和 引物序列及二者间的配对情况的显示;第三层是显示两个引物的各种参数，包括给 引物的打分，引物以及产物的起始位置、长度、Tm值、GC,消光系数、简并性;最 后一层是给出的有关于引物的二聚体结构、发卡结构、错配情况 和引物间二聚体结构的预测，左边是显示是否存在以上各种对PCR扩增有影响 的结构，右边显示的是这些结构的位置，结构细节和稳定能，利用这些参数可以对 引物作出可靠的评价。 下面是根据模板序列寻找引物的界面，在该界面中可以设定所要搜索的引物的 类型，包括 PCR 引物，测序 引物和杂交探 针以及引物所 在的链;另外也 能设定搜索引 物的范围，以及 最终PCR产物 的长度和引物 的长度等。 并通过来点击按钮来设置一些搜寻参数: 这些参数包括引物的Tm值，GC 比，有简并性碱基，3’端稳定性，引物的稳定 性，重复序列，二聚体/发卡结构和与模板及可能的杂质DNA(需要从另外的序列文 件中读入)之间的错配情况，这些参数的设定可以根据要求变化，程序本身根据一 定的标准分成从极高严谨性到极低严谨性5个档次。该程序对引物的自动搜索过程 是采用的排除法，根据用户设定的引物范围和产物长度所规定区域内，所有的符合 设定的引物长度的寡核苷酸都被视为可能的引物，然后根据以上各个参数逐步去除 不符合条件的寡核苷酸，经过这种层层剔除的筛选，最终找到符合用户所设定标准 的引物，如果找不到合适的引物可以逐步降低要求来进行进一步搜寻。 搜寻到引物结果最终显示在下面的窗口中: 在结果窗口中给出了程序给 该对引物的打分(rating)和 上下游引物的起始位置和长 度以及产物的长度。通过直 接点击各对引物在相应引物 搜寻界面中相应的显示引物 的各种信息。包括其各种参 数和各种可能存在的不利结 构。 其中用File菜单中的 Parameter命令可以对系统参数，PCR反应条件和程序打分系统进行设置，以 帮助用户根据自己的特殊要求来进行引物设计，其中反应条件按照引物浓度，单价 离子浓度，Mg离子浓度，Na盐浓度等。而打分系统是参照的以下公式: 利用该打分系统可以为对引物进行有效评估和和在引物之间进行对比选择提供 有效的有效的依据。 最后还可以在利用引物编辑窗口对程序自动找到的或手工找到的引物序列进行 编辑，以便用户能在引物引入突变及加入特定的酶切位点，并对修改后的序列的二 聚体结构、发卡结构和错配进一步评估。其中是对修改后的引 物再次搜寻找出其最合适的引发位置。 除了以上的直观地对引物进行基本的设计和评估功能外，该程序还提供了多种 数据报告，主要通过Report菜单和Graph菜单中命令来实现: 另外，Primer Premier 在引物设计上一个比较独到的功能，就是能辅助进行巢 式 PCR 引物设计，在首先进行了引物自动搜索后，即可通过Function 菜单中 Multiplex/Nested Primer 命令进入巢式 PCR 引物设计，通过点中代表各个引物的 三角号来选择引物，然后根据最下面的窗口中各个引物之间的二聚体形成情况来判 断引物是否适合于作为巢式PCR 的引