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支原体检测方法汇总 一、培养法 二、荧光指示细胞法 三、PCR法 四、扫描电子显微镜法 目前实验室常用的支原体检测方法有培养法、荧光指示细胞法、PCR法、扫描电子显微镜法，这些方法各有优缺点。各实验室可根据具体情况，选择不同的方法，或几种方法联合使用。 一、培养法 培养法为最为经济可靠的方法，但其实验周期较长，所以常用来进行对怀疑细胞的最后甄别。常用于细胞及临床治疗细胞的支原体检查。 （一）材料与设备 .精氨酸肉汤培养基按说明称量粉剂，蒸用水配制，高压除菌（力口20%胎牛血清）。 .支原体琼脂培养基按说明称量粉剂，蒸锵水配制，高压除菌（力口20%胎牛血清）。 .其他超净工作台、无菌吸管、试管架、培养试管/皿、37t培养箱。 （二）操作步骤 L样品的储存。样品取材后，最好尽快进行检测。样品如在24h以内进行支原体检测，可储存在2~89；如果超过24h样品应放置于一2（ΓC以下保存。-2（ΓC保存的样品，进行检测时需重新加入到对照培养细胞中，培养72h后，取上清直接进行接种检测。 2.准备精氨酸肉汤培养基、支原体琼脂培养基（半流体）。 3,将样品分别接种到10ml精氨酸肉汤培养基、半流体培养基中（已冷却至36℃）,每支培养基接种样品0?5~L0mL每种样品接种6支精氨酸肉汤培养基，3支半流体培养基。 4.接种6d后，取3支精氨酸肉汤培养基中样品0.51.0ml.复种于精氨酸肉汤培养基中。 5.36℃培养295每隔3（1观察一次。记录实验结果。 （三）结果判断 培养结束时，精氨酸肉汤培养基如有支原体生长，则液体颜色改变（粉色或黄色）。 半流体培养基中如有支原体生长，则出现絮状沉淀 二、荧光指示细胞法 荧光指示细胞法较为快捷，方法简单，但其灵敏度有一定的欠缺，易造成漏检。 常见的支原体检测方法中最简单、最经济的方法是荧光指示细胞法。该方法使用的荧光染料是烟酸己可碱，其激发波长为350nm（紫外激发），发射波长为420nm。该染料会结合到DNA中富含A-T的区域，由于支原体的DNA中A-T含量占多数（55%~80%）,所以可被染色而检测到。支原体污染的细胞经染色后，在细胞核外与细胞周围可看到许多大小均一的荧光小点，即为支原体DNA,证明该细胞有支原体污染。 （一）材料与设备 L荧光显微镜。2.CO2培养箱。3.无菌小爬片。4.无菌培养皿。 .不含抗生素的完全培养液。 .二苯甲酰胺荧光染料浓缩液（50μg∕ml）o称取5mg二苯甲酰胺荧光 染料加入100ml不含酚红和碳酸氢钠的Hanks平衡盐溶液中，在室温下用磁力搅拌30~40min,使完全溶解，一2（ΓC避光保存。 .二苯甲酰胺荧光染料工作液（0.5μg∕ml）°取1ml上述浓缩液，加至至0ml无酚红和碳酸氢钠的Hanks溶液中,终浓度为0.5μg∕mlo 8,固定液，即乙酸：甲醇（1:3）溶液为细胞固定液。 .封片液。0.lmol∕L枸檬酸22.2ml,0.2mol∕LNa2HP04?12H2027.8ml,丙三醇50.0ml,以上三者混匀，调pH至5.5。 .不含酚红和碳酸氢钠的Hanks平衡盐溶液或PBSo经多种方法检测确定为支原体阴性的VERO细胞。 （二）操作步骤 .无菌收集待测细胞上清：悬浮细胞离心后取上清液。 .VER0细胞爬片：将爬片无菌置于小培养皿内，滴加VERO细胞悬液（细胞浓度约3X104个∕ml）2~3ml,置于C02培养箱内培养24h使其贴壁。 .制备标本。向6孔板内滴加待检细胞上清液约1ml,注意设立对照组（已证实的支原体阳性和阴性细胞上清液），培养48h后（VERO细胞汇合前）将细胞爬片从平皿中取出。 .漂洗一将细胞爬片置于培养皿中，用不含酚红、NaHC03的Hanks溶液（或PBS）漂洗3次。 .固定一用乙酸：甲醇（1:3）固定液固定10min. ,漂洗一待固定液自然风干后用去离子水漂洗3次。 .染色一置于Hoechst33258工作液(0.5μg∕ml)中染色10mi∏o 8,漂洗一去离子水中漂洗3次，每次l~2min. 9.封片，紫外激发，观察。 （三）结果判断 当阴性及阳性对照结果均成立时，结果有效。 .阴性结果仅见待检细胞的细胞核呈现蓝色荧光。 .阳性结果荧光显微镜下细胞周围或细胞膜表面可见大小不等、不规则的蓝色荧光小点和丝状点。 （四）小结 L严格配制工作液及封片液。 .保证作为指示细胞的VERO细胞没有被支原体污染。 .必须同时设立阳性及阴性对照，注意重复，以排除假阳性和假阴性结果。4.应全面观察爬片，并注意可疑阳性的荧光点是凋亡小体还是支原体污染。 5.可适当调整荧光染料的工作浓度和染色时间，避免出现非特异性染色，如胞浆着色。 三、PCR法 PCR法检测支原体的方法最为快速、灵敏、取样量少，既可做细胞本身，也可做细胞上清的检测，同时可以检测