干扰素生产工艺培训讲课.ppt

第1页，共35页。 干扰素的理化性质 143-166aa； MW:18-40 ku； pI: 6.5-7.5； 乙醚、氯仿敏感 容易吸附玻璃、淀粉、醋酸 纤维膜、琼脂和塑料等介质。 第2页，共35页。 工艺流程 基因工程假单胞杆菌的构建 摇瓶培养 发 酵罐培养 菌体收集 菌体裂解 预处理-沉 淀 初级分离 溶解粗干扰素 沉淀 与疏水层析 阴离子交换层析与浓缩 阳离子 交换层析与浓缩 凝胶过滤层析 无菌过滤分 装 检测 30℃，pH7.0 18±2h 30℃，pH7.0 16000 r/min离心 2℃～10℃ 16000 r/min 第3页，共35页。 干扰素生产工艺路线（1） 体外诱生干扰素制备工艺： Sendai病毒诱导人白细胞 1989年：IFNα-n3/Alferon，批准上市 产量低：1g IFNα，需要 3亿ml人血白细胞 来源困难，工艺复杂，收率低，价格昂贵 潜在的血源性病毒污染的可能性 第4页，共35页。 干扰素生产工艺路线（2） 人源转化细胞系培养生产工艺： 1999年：IFN α-n1/Wellferon, 批准用于临床。 优点：首次实现大规模商业化生产。 缺点： 活性低，退出临床应用。 第5页，共35页。 干扰素生产工艺路线（3） 上市产品：重组人干扰素rhuIFN 1986，rhuIFNα-2a， rhuIFNα-2b； 2001－2002： PEG化IFN，PEG-Intron, Pegasys 表达产物：无糖基化，N-met，无活性包涵体 工艺特点：发酵过程，随后变性、复性过程。 基因工程大肠杆菌发酵生产工艺: 第6页，共35页。 干扰素生产工艺路线（4） 上市产品：rhuIFN β-1a 1996， Avonex(Biogen)； 2002， Rebif(Serono) 表达产物：166 aa 糖基化蛋白，22.5 ku 工艺特点：分泌表达，产量低，成本高,过程严格 动物无限细胞系培养生产工艺： 第7页，共35页。 干扰素生产工艺路线（5） 宿主：腐生型假单胞杆菌（Pseudomonas putida） 上市产品：IFN α-2b/安福隆 表达产物：无糖基化可溶性蛋白质，具有天然分子结构和生物活性 工艺特点： ①发酵周期短（几个小时） ②无需变性、复性过程，获得有活性产品 纯化过程：淘汰抗体亲和层析 基因工程假单胞杆菌发酵生产工艺 第8页，共35页。 一、基因工程假单胞杆菌的构建 基因工程假单胞杆菌菌种建立 基因工程假单胞杆菌菌种特性 第9页，共35页。 （一)-基因工程假单胞杆菌菌种建立 第一步：干扰素α-2b基因的克隆 第二步：表达载体的构建 第三步：工程菌的构建 第10页，共35页。 第一步：干扰素基因的克隆(RT-PCR) 制备白细胞，病毒诱导，分离mRNA,反录酶合成cDNA,PCR， 基因连接质粒, 转化E.coli,筛选鉴定克隆。 测序：编码人IFNα-2b基因序列,501bp，165aa。 第11页，共35页。 第二步：表达载体构建 IFN基因与表达载体连接 转化大肠杆菌 筛选阳性克隆 获得序列正确表达载体 第12页，共35页。 第三步：工程菌构建 转化假单胞杆 筛选高表达、稳定遗传的工程菌 获得原始菌种 第13页，共35页。 （二）基因工程菌的特性 （1）具有宿主菌的特征： 细菌：革兰氏阴性菌，有荚膜，无芽孢，杆状。 菌落：直径2.5-3.0 mm，灰绿色半透明状,粘稠。 生化特性:Ser-，L-Val、D/L-Arg和L-Thr为 （2）工程菌的特征：SmR、TcR、ApR （3）具有生产干扰素能力：放射性免疫学效价不低于2.0×109 IU/L。 第14页，共35页。 二、干扰素α-2b的发酵工艺过程 第15页，共35页。 1、摇瓶培养 取保存工作种子批菌种，室温融化 摇瓶培养：30℃，pH7.0，250 r/min，18±2h 检测：OD值和发酵液杂菌检查。 第16页，共35页。 2、种子罐培养 接种：接入50L种子罐，接种量10%。 培养：30℃，pH7.0。 控制：级联调节通气量和搅拌转速，DO为30%，3～4h，OD4.0。 检测：显微镜和LB培养基划线检查，控制杂