实验九差示分光光度法测定维生素B1片的含量.docxVIP

;. . .. 实验九 差示分光光度法测定维生素 B 片的含量 1 一、实验目的 1 ．掌握差示分光光度法的基本原理。 2 ．熟悉标准曲线定量的操作方法。 二、实验原理 (一)差示分光光度法(简称△A 法)，它保留了通常的分光光度法简便、快捷、直接 读数的优点，又无需事先分离，并能消除干扰。 方法：取两份相等的供试液，分别制成两种不同的化学环境(如在其一中加酸或碱， 改变 pH 或在其一中加能与供试品发生某种化学反应的试剂)，然后将它们稀释至同样浓度 后，分置于样品池和参比池中，于适当波长处，测定吸光度的差值(△A)。 应用条件：①供试品在不同的化学环境中以不同的分子形式存在，它们的吸收光谱有 显著的差异；②干扰物的吸收不受测定时化学环境的影响，光谱行为不变。 定量依据：设x、y 分别代表在两种不同的化学环境中供试品的存在形式，它们在测定 波长处的吸光度以 Ax 、Ay 表示， 背景和干扰的吸收度以 AZ 表示， AZ 不受测定时化学环境 改变的影响。根据吸光度加和性原则： 即在供试液的一定浓度范围内△A 值与其浓度 C 呈线性关系， 并消除了 AZ 的干扰， 可 用标准曲线法或对照法定量。 (二)维生素 B1 片的测定 维生素 B1 分子中具有共轭双键结构，在紫外区有吸收，其紫外吸收随溶液 pH 的变化 而变化。在 pH7 的磷酸盐缓冲液中具有两个吸收峰， 在 232~233nm 处，E 1% =345；在 266nm 1cm 处， =255。在 pH2 时，最大吸收在 246nm 处， =425。可用于维生素 B1 片的差示 分光光度法的测定。 三、实验方法 (一)测定波长的选择 精密称取维生素 B1100mg，用水溶解并稀释成 100ml，精密量取 2ml 二份，分别用缓 冲液(pH 7.0)和盐酸液(pH 2.0)稀释成 100ml，以相应溶剂为空白， 测定紫外吸收光谱。 再将 . .. 前者放于参比池， 后者放于样品池， 绘制差示吸收光谱(见图 11)。差示光谱图表明在 247nm 处有最大差示吸收值(△A)，确定 247nm 为测定波长。 (二)标准曲线绘制 精密称取干燥至恒重的维生素 B1100mg，置 100ml 量瓶中， 用水溶解并稀释至刻度,摇匀，作为贮备液。精密量取 1.0、1.5、 2.0、2.5、3.0ml 贮备液各二份，分别置 100ml 量瓶中，一份用 缓冲液稀释至刻度；另一份用盐酸溶液稀释至刻度，摇匀。取 上述五组浓度相同， pH 不同的溶液，在 247nm 处分别测定差 示吸收值(△A)。以浓度 C 为横坐标，以差示吸收值△A 为纵坐 标绘制标准曲线或进行回归，求得回归方程和相关系数。 (三)样品测定 取本品 20 片，精密称定，研细。精密称取适量粉末(约相 当于维生素 B1 50mg)，置 50ml 量瓶中，加水溶解并稀释至刻 度，摇匀，滤过，弃去初滤液，精密量取续滤液 2ml 二份，分 别置 100ml 量瓶中，分别用缓冲液和盐酸液稀释至刻度，摇匀。 将前者置参比池中，后者置样品池中，在 247nm 波长处测定差 示吸收值。由标准曲线求得维生素 B1 ，浓度，计算维生素 Bl 片的 标示量％。 本品含维生素 Bl(C12H17ClN4OS ·HCl)应为标示量的 90.0％~110.0％。 四、注意事项 1．由于仪器波长可能存在差异，所给测定波长仅供参考，可照“测定波长的选择”项 下自行测定。 2．测定标准系列各细溶液的△A 时，一定要遵循先稀后浓的原则，尽可能消除测定误 差。 五、思考题 1．差示分光光度法的优点是什么？ 2．差示分光光度法是怎样消除干扰的？