使用RNAscope-技术探索-HBV-DNA--cccDNA以及mRNA-在肝组织中的分布.docxVIP

使 用 RNAscope- 技 术 探 索 -HBV-DNA--cccDNA 以及mRNA-在 肝组织中的分布 使 用 RNAscope 技 术 探 索 HBV DNA ， cccDNA 以及 mRNA 在肝组织中的分布 简介 HBV 的感染侵入病人体内细胞后，其内含的 HBV-DNA 脱 离 包 裹 的 蛋 白 质 被 释 放 形 成 rcDNA，依赖宿主的 DNA 聚合酶补齐形成更加 稳定的 cccDNA，并以 cccDNA 作为模板转录出 不同大小的 mRNA，作为各种抗原蛋白以及 HBV-DNA 的逆转录模板。 基于各类核酸不同但 同样重要的作用，本工程旨在用一种新型的 RNA ISH 技 术 RNAscope@ 来 标 定 HBV-DNA ， cccDNA ， mRNA，探索各类核酸在乙肝病人组 织中的差异分布， 并比拟在乙肝病人四个开展阶 段〔immunotolerant, immune active, inactive carrier, and HBeAg-negative hepatitis〕的不同 变化， 以及 INF 治疗效果不同病人之间的差异变 化。本工程有助于我们进一步了解 HBV 传播的 机制，为 HBV 的治疗提供指导。 背景 HBV cccDNA 的形成 HBV 侵入人的肝细胞 ,在细胞质中脱去核壳 , 形成 rcDNA。rcDNA 进入肝细胞核中解脱正链 3′端连接的末端蛋白、负链 5′端的 RNA 残段 〔图一〕 ;依赖宿主细胞的 DNA 聚合酶补齐两 条链上的缺口 ,并进一步折叠、扭曲形成超螺旋 结构的 cccDNA ,并以 cccDNA 为模板转录为 不同大小的 mRNA ( 3.5Kb 、 2.4Kb、2.1Kb、 0.8Kb mRNA) ,从而翻译各种病毒蛋白。其中 3,5 Kb 的 pgRNA 作为逆转录模板 ,利用病毒 的逆转录酶合成全长的基因组负链 DNA ,再以 负链 DNA 作为模板 ,通过病毒 DNA 聚合酶 的作用 ,合成正链 DNA , 与负链 DNA 一起组 成新的 HBV rcDNA。新合成的 HBV rcDNA 一 方面进入细胞核内 ,转化为新的 cccDNA ,补充 细胞内的 cccD2 NA 库 ,使每个肝细胞中保持 大约 5~50 个 cccDNA 分子 ;另一方面与病毒 蛋白装配成新的完整 HBV ,释放至细胞外 ,再感 染健康的肝细胞 (见图 1) [1]。 In HBV genome, the incomplete plus strand has a variable 3‘ -end but a defined 5’-end around position 1600 near DR2, while the complete minus strand has defined 5‘ - and 3’ -ends with a terminal redundancy of 9 bases [27]. There is a gap around position 1800 near DR1 (Fig. 1). 图一 HBV 基因组结构。HBV 基因组有局部单链， 局部双链， 以及局部的三 DNA 链在病毒粒子中。 各 HBV 正义链的长度会有很大的不同，但是负 义链有固定的 5‘ -和 3’-端靠近 1800 左右的位 置。圆圈，引物酶；钻石圈， DNA 聚合酶。 2. 传统 HBV cccDNA 的常用检测方法 根据 cccDNA 与 rcDNA 在结构和理化特性上的 不同 , 可以建立检测 cccDNA 的方法 : (1) rcDNA 能与蛋白质共价结合 ,cccDNA 那么不 能。 (2) rcDNA 的双链是不对称的 ,全长的一链 与病毒 mRNA 互补 ,为负链 ,较短的一链为正 链。 在正链和负链上均存在缺口 ,两链 DNA 通 过 5′端 250~300 个互补碱基的氢键作用形成 局部环状结构 ,而非超螺旋结构 ; cccDNA 的 两条链均是完整的 , 形成超螺旋结构。 (3) 由于 正链和负链上均有缺口存在 ,rcDNA 可以被一 些能够切除单链或含有缺口 DNA 的核酸酶如 Plasmid2Safe TM A TP2dependent DNase、绿 豆核酸酶(mung bean nuclease) 等降解成寡核 苷酸或单核苷酸 ,而 cccDNA 那么由于双链结 构完整 ,不会被上述酶降解[2,3]。 (一) Southern blot HBV cccDNA 以往多用 South