第二章基因工程载体和工具酶.ppt

不同粘性末端的连接 BamHI 5 5 GGATCC CCTAGG GGATCC CCTAGG 5 G CCTAG GATCC G 5 5 CTGCA G 5 G ACGTC 3 T4-DNA ligase CGATCC GCTAGG 5 5 GGATCG CCTAGC 5 CTGCAG GACGTC 5 PstI 3 T4-DNA pol 切平 5 C G 5 G C Klenow 补平 5 GGATC CCTAG GATCC 5 CTAGG CGATCC GCTAGG 5 5 GGATCG CCTAGC 第九十四页，共一百一十六页。 DNA连接酶的反应条件： Tris-HCl 50 - 100 mM pH 7.5 MgCl2 10 mM ATP 0.5 - 1 mM DTT 5 mM Volume 10 - 20 ml T T 4 - 15 ℃ 4 - 16 hr 1 U DNA连接酶的酶活性：在最佳反应条件下15 ℃反应 1 小时，完全连接 1 mg l-DNA（Hind III片段）所需的酶量 第九十五页，共一百一十六页。 重组率 重组率的定义 重组率 = 含有外源DNA的重组分子数 / 载体分子总数 在常规实验条件下，重组率一般为25 - 75% 提高重组率的方法： ①提高外源DNA片段与载体的分子比：5 : 1 - 10 : 1 ②载体DNA分子在连接前先除去磷酸基团 ③平头末端增加同聚物尾巴 第九十六页，共一百一十六页。 转化率 转化率的定义 转化率是每微克载体DNA在最佳转化条件下进入受体细胞的分子数。由于在一般的转化实验规模下，每个受体细胞最多只能接受一个载体分子，因此转化率的定义也可以表征为：每微克载体DNA转化后，受体细胞接纳DNA的个数，即克隆数 第九十七页，共一百一十六页。 转化率的计算 例如，pUC18对大肠杆菌的转化率为108，即每微克pUC18中只有108个分子能进入受体细胞。一微克pUC18共有3.4X1011个分子（6.02X1017 / 2686X660），也就是说，每3400个pUC18分子才有一个分子进入受体细胞。 另一方面，在实际操作过程中，转化一微克pUC18共需2ml感受态细胞，大约含有2X1010个大肠杆菌细胞，也就是说，每200个细胞只有一个细胞能接纳pUC18 DNA 第九十八页，共一百一十六页。 转化率的影响因素 （1） 载体及DNA重组分子方面： 载体本身的性质与插入片段的大小 （2）受体细胞方面： 受体细胞必须与载体相匹配，例如：pBR322转化大肠杆菌JM83株，转化率很低；但对大肠杆菌ED8767株的转化率则较高 第九十九页，共一百一十六页。 转化率的影响因素 （3）转化方法方面： Ca2+诱导转化 106 - 107 / mg DNA l-DNA转染 107 - 108 / mg DNA 电穿孔转化 106 - 109 / mg DNA 第一百页，共一百一十六页。 3.大肠杆菌DNA聚合酶 I 5‘→3‘的DNA聚合酶活性 5‘→3‘的核酸外切酶活性 3‘→5‘的核酸外切酶活性 大肠杆菌DNA聚合酶 I的基本性质： 3‘ … G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-A… 5’ 5‘ … C-G-A-G-T-OH 5‘ ppp dN Mg2+ 3‘ … G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-A… 5’ 5‘ … C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-OH DNA pol I 第一百零一页，共一百一十六页。 缺口前移标记法 大肠杆菌DNA聚合酶 I 的基本用途： 5‘ … G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T… 3’ 3‘ … C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A… 5‘ Mg2+ 5‘ dNTP 5‘ ppp dA（a-32P-dATP） 5‘ … G-C-T-C A-G-C-T-G-G-A-G-T… 3’ 3‘ … C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A… 5‘ 5‘ … G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T… 3’ 制备32P标记的探针 DNase I DNA pol I 3‘ … C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A… 5‘ 第一百零二页，共一百一十六页。 大肠杆菌DNA聚合酶 I 大片段（ Klenow ） Klenow酶的基本性质： 大肠杆菌DNA聚合酶I经枯草杆菌蛋白酶处理，获得N端 三分之二的大肽段，即为Klenow酶 Klenow酶仍拥有5‘→3‘的DNA聚合酶活性和3‘→5‘的 核酸外切酶