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一文读懂免疫组化步骤、 结果分 析及考前须知 一文读懂#160; 免疫组化步骤、结果分析及考前须知... 导语实验室花花师姐正在教导新来的师弟： “想拿高分 文章，不学免疫组化怎么行？〞免疫组化王子毛博旁边插 话： “是这个理，今天我就豁出去，将我十多年的心得和经 验奉献给小师弟你了。〞小师弟感谢涕零，唯诺细听两位前 辈的教诲...... 免疫组化， 免疫组织化学技术〔immunohistochemistry〕，是 一项利用抗原抗体反响， 通过使标记抗体的显色剂显色来确 定组织细胞内抗原，对蛋白定位，定性的实验技术。免疫组 化主要用的是组织标本和细胞标本两大类， 组织标本包括石 蜡切片〔病理切片和组织芯片〕和冰冻切片。石蜡切片，对 组织形态保存好，保存时间也长，虽然对组织抗原暴露有影 响，但可以抗原修复，所以石蜡切片仍然是首选的标本制作 方法。 免疫组化步骤详解 免疫组化结果分析很多时候，我 们千辛万苦地染出了一张张漂亮的免疫组化片子。 但是却不 知道如何正确地分析， 得出理想的结果。 这实在是一件憾事。 如下列图，正常的结果应该是这样的：镜下细胞核呈蓝色， 阳性结果呈深浅不一的棕色。结果分析主要有两种方法，阳 性着色细胞计数法和评分法。前者是在 40*光镜下，随机 10 个视野下计数阳性着色细胞； 后者那么是在光学显微镜下按 染色程度〔0 分阴性着色， 1 分淡黄色， 2 分浅褐色， 3 分深 褐色〕 和阳性范围〔1 分 0-25%，2 分 26-50%，3 分 51-75%， 4 分 76-100%〕评分，最终分数相加。 免疫组化结果分析是毛博的特长，以下是他传授的独门绝 技。 1.对照染色 和做实验的时候必须设立对照组一样， 免疫组化也必须设立 对照染色。没有对照染色的免疫组化结果是不可信的。对照 一般有阳性组织对照，阴性组织对照，阴性试剂对照，自身 对照。一般来说，有一个阳性组织对照和一个阴性组织对照 就足够了。 2.定位 抗原表达必须在特定部位。如 LCA 应定位在细胞膜上； CK 应定位在细胞浆内； PCNA 及 p53 蛋白应定位在细胞核内等 等。不在抗原所在部位的阳性着色，不能视为确切的阳性结 果。有可能是非特异性染色或者假阳性。不能确定怎么办？ 这就要用到上一段提到的对照染色了。 3.半定位 现在一般用图像分析系统进行定量。 如果你的实验室不幸没 有那么高大上的话， 就只好赶鸭子上架， 用肉眼定一下量了。 因为人为主观性比拟强，所以只能称作半定量。免疫组化的 半定量一般就分为三级：弱〔+〕，中〔++〕，强〔+++〕。以 绿色免疫荧光为例，那么表现为浅绿色荧光、明显绿色荧光 和亮绿色耀眼荧光。弱〔+〕=1，中〔++〕=2，强〔+++〕 =3。至少随机观察 5-10 个 HPF。然后根据〔+〕% x 1 +〔++〕% x 2 +〔+++〕% x 3 计算出数值；总数值 1.5 者为(+++) 。4. 图像分析仪 如果要进行精确定量的话，就要用到图像分析仪。图像分析 仪类型很多。这里就不一一介绍了。其实毛博最想隆重推荐 的是一款图像分析软件： Image J。毛博当年在米国做博士 猴的时候，就是用的这款软件。这是 NIH 开发的免费软件。 一般的免疫组化结果分析用它就绰绰有余了。 现在已经开发 到了 1.50 版。网上可以免费下载。 其界面非常简洁， 如下列 图所示。现在，根据一个实例来看看如何用 Image J 来进行 图像分析。如下列图所示，我们有一张细胞的免疫荧光染色 的照片。 那么， 如何用 Image J 来计数细胞的个数呢？首先， 要把彩色的图像转换成黑白图像。步骤如下： Image →Type →16-bit。转换成黑白图像后，将要计数的局部用高亮标示 出来。步骤如下： Image →Adjust →Threshold。然后拖动鼠 标，直到所有的细胞被标示出来。有时候 2 个细胞靠得比拟 紧密，会被计数为 1 个细胞。这个时候可以采用 Image J 的 水洗功能。步骤如下： Image →Binary →Watershed。如下列 图的蓝色箭头所示，这些是本来计数成一个的细胞，经过水 洗之后，更加精确地被计数成了 2 个细胞。然后，就可以正 式开始分析了。步骤如下： Analyze →Analyze Particles。在 得出最后的结果之前，还有一些选项需要选择。如果想要计 数全部的细胞，那么 Size 项里面选择“0-infinity〞。 Circularity 的默认值为“〞。一般就取默认值。最后的结果 如下列图所示。软件自动测量了每个细胞的大小。这里因为 是二维图像，所以就是每个细胞的面积。然后计数了一共有 72 个细胞，总面积为 21286.00，平均大小为 295.64。免疫组 化