实验紫外吸收法测定蛋白质含量.ppt

关于实验紫外吸收法测定蛋白质含量 第1页，共16页，2022年，5月20日，22点18分，星期三 一、 实验目的： 学习紫外分光光度法测定蛋白质含量的原理； 熟练掌握紫外分光光度计测定原理及使用方法。 第2页，共16页，2022年，5月20日，22点18分，星期三 二、 实验原理： 由于蛋白质中存在着酪氨酸、色氨酸及苯丙氨酸残基，它们的结构中具有共轭双键，对紫外光有吸收作用，其吸收高峰在280nm波长处，且在此波长内吸收峰的光密度值OD280nm与其浓度（范围是0.1~1.0mg/ml）成正比关系，280nm的吸光度故可作为蛋白质定量测定的依据。 第3页，共16页，2022年，5月20日，22点18分，星期三 第4页，共16页，2022年，5月20日，22点18分，星期三 本法操作简便迅速，且不消耗样品(可以回收)，低浓度的盐类不干扰测定，在蛋白质和酶的生化制备及其它研究中应用广泛，多用于纯化之蛋白质的微量测定，尤其是适合于柱层析分离中蛋白质洗脱情况的检测。 核酸在280nm波长下也有一定吸收能力，可能发生干扰。混有核酸时必须分别测定280nm和260nm两处的OD值，然后根据两种波长的吸收度的比值，通过经验公式校正，以消除核酸的影响而推算出蛋白质的真实含量，再按公式推算蛋白质含量。 第5页，共16页，2022年，5月20日，22点18分，星期三 三、 实验材料、主要仪器和试剂 1．试验材料：待测的蛋白质溶液。 2． 主要仪器： （1）紫外分光光度计 （2）试管与试管架 （3）移液管 3．试剂：浓度为1mg/mL标准酪蛋白溶液 第6页，共16页，2022年，5月20日，22点18分，星期三 四、操作步骤 1．标准曲线制作 按表1分别向每支试管内加入各种试剂，混匀。以光程为1cm的石英比色杯，在280nm波长处测定各管溶液的光密度值OD280nm。 以蛋白质浓度为横坐标，光密度值为纵坐标，绘出标准曲线。 第7页，共16页，2022年，5月20日，22点18分，星期三 2．样品测定： 取待测蛋白质溶液1mL，加入蒸馏水9mL，混匀，按上述方法测定280nm的光密度，并从标准工作曲线上查出待测蛋白质溶液的浓度。 第8页，共16页，2022年，5月20日，22点18分，星期三 第9页，共16页，2022年，5月20日，22点18分，星期三 分光光度计的使用 第10页，共16页，2022年，5月20日，22点18分，星期三 分光光度计的分类 分光光度计的分类 红外分光光度计: 可见光分光光度计: 紫外分光光度计: 测定波长范围为大于760 nm的红外光区 测定波长范围为400~760 nm的可见光区 测定波长范围为200～400 nm的紫外光区 第11页，共16页，2022年，5月20日，22点18分，星期三 分光光度计的基本结构 无论哪一类分光光度计都包括 ：光源、单色器、吸收池、检测器和测量仪表。分光光度计各部件的次序如图所示: 5个基本部件 第12页，共16页，2022年，5月20日，22点18分，星期三