第九章基因工程和基因组学.pptVIP

第29页，共60页，编辑于2022年，星期一 第30页，共60页，编辑于2022年，星期一 2. 筛选基因库 从基因库中筛选、分离基因，可据对待选基因相关信息的了解程度，确定筛选方法和条件。大多数方法是利用一段核苷酸序列作探针(probe)，用放射性同位素或非放射性同位素标记探针，作探针，筛选基因库 第31页，共60页，编辑于2022年，星期一 第32页，共60页，编辑于2022年，星期一 3. 阳性克隆的分析与鉴定 从基因库中筛选出的阳性克隆，还需进一步分析、鉴定，才能最后得到目的基因。 第33页，共60页，编辑于2022年，星期一 ①限制性酶图谱 构建阳性克隆的限制性酶图谱常是分析阳性克隆的第一步。根据同源性分析，可以了解阳性克隆片段的酶切位点及相对位置，用于进一步亚克隆或同已知的其它序列比较。 第34页，共60页，编辑于2022年，星期一 图9－12表示一个15kb DNA片段的限制性酶图谱构建方法。 第35页，共60页，编辑于2022年，星期一 这个方法首先是将DNA用限制性酶酶切，然后将酶切的DNA进行琼脂糖凝胶电泳，经过变性处理后，将凝胶上的DNA转移到膜上，再用经过放射性同位素或非放射性同位素标记的DNA探针与膜上的DNA片段杂交，洗去膜上非特异性结合的探针后，用X-光片放射自显影检测杂交信号 ②核酸分子杂交 Southern杂交分析(Southern blotting)是基因工程中常用的方法。 第36页，共60页，编辑于2022年，星期一 第37页，共60页，编辑于2022年，星期一 ③核酸序列测定 只有将克隆后的DNA片段进行核酸序列测定后，才能最后确定这个DNA片段的序列是否正确。大多数核酸序列测定采用由Sanger于1977年发明的双脱氧核糖核酸链终止法。 第38页，共60页，编辑于2022年，星期一 第39页，共60页，编辑于2022年，星期一 ④核酸序列分析 测定的核酸序列是不是所需要的基因，或具有什么功能，还要用计算机软件或生物学实验进一步分析，才能最后得出结论。 第40页，共60页，编辑于2022年，星期一 (二)聚合酶链式反应(PCR)扩增基因 聚合酶链式反应(polymerase chain) PCR反应包括三个步骤： 变性：在94-95℃使模板DNA的双链变性成单链。 复性：两个引物分别与单链DNA互补复性，复性的温度在50-70℃。 延伸：在引物的引导及Taq 酶的作用下，于72℃合成模板DNA的互补链。 第41页，共60页，编辑于2022年，星期一 第42页，共60页，编辑于2022年，星期一 第九章基因工程和基因组学 第1页，共60页，编辑于2022年，星期一 基因工程是一种操作，它不是通过一般传统的有性杂交方法，而是采取类似于工程建设的方式，按照预先设计的蓝图，借助于实验室的技术，将某种生物的基因或基因组转移到另一种生物中去，使后者定向地获得新的遗传性状，成为新的类型。 第2页，共60页，编辑于2022年，星期一 第3页，共60页，编辑于2022年，星期一 基因工程的施工程序大致分为四个步骤：1、为施工准备材料，即“目的”基因、载体和工具酶等。2、把目的基因与载体结合成重组DNA分子。 第4页，共60页，编辑于2022年，星期一 3、把重组DNA分子引入受体细胞，建立分子无性繁系(Clone)或称克隆。4、从细胞群体中选出所需要的无性繁殖系，并使外源基因在受体细胞中正确表达。 第5页，共60页，编辑于2022年，星期一 二限制性内切酶??? 细菌细胞具有防御异源遗传信息进入的手段。异源DNA分子进入细菌细胞后，在许多情况下遭到毁灭，这个过程称为限制。限制的能力来源于微生物的一种特殊的酶，称为限制性核酸内切酶。这是一种水解DNA的磷酸二脂酶，它是遗传工程上的一种极其重要的工具酶。 第6页，共60页，编辑于2022年，星期一 第7页，共60页，编辑于2022年，星期一 在酶解时，DNA双链不在同一地方断开，因而产生的片段两端都带有数个碱基的单链尾巴，这两个单链尾巴带有互补的碱基配对顺序，可以互相自动接合成为环状DNA，因此称为粘性末端。 第8页，共60页，编辑于2022年，星期一 第9页，共60页，编辑于2022年，星期一 第10页，共60页，编辑于2022年，星期一 三载体 (一) 质粒 质粒是在细菌中发现的，它是易于取出和引入的小型环状DNA。一般有1～200Kb左右(Kb为千碱基对)它的DNA分子很小，一般为细菌染色体DNA的