实验室常用技术.docxVIP

实验室常用技术资 料 Lab.experimenttechnology LQ 1 细胞冻存 1.实验前准备：细胞室及工作台紫外线照射30min；吹打管、中枪头、中枪、培养液、PBS、胰酶、小牛血清、DMSO、；收集对数生长久细胞，在冻存前一天最好换液 2．用吸管吸出培养瓶中的细胞培养液，PBS冲洗2遍吸出冲刷液，加入胰蛋白酶消化。 适时去掉胰蛋白酶，加入少量新培养液。吸管吸取培养液吹打瓶壁上的细胞，使其成为平均分别的细胞悬液。 4.用吸管将培养液加入冻存管中，离心1000r/min，8分钟。(能够留下一部分细胞悬液在培养瓶中持续培养) 用中枪吸去上清液直至冻存管内节余1ml培养液，加入110ulDMSO(二甲基亚枫)，用枪头轻轻吹打使细胞平均。 冷存管置于4℃30min20℃30min80℃16～18小时(或隔夜)液氮槽长久储藏。(-20℃不可超过1h，以防备胞内冰晶过大，造 2 成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入-80℃冰箱中，惟存活率稍微降低一些)。 7．记录每一个冷冻管的地点以保证在此后应用时能够找到每一个冷冻管。 细胞复苏 冷冻细胞之活化原则为快速解冻，以防止冰晶从头结晶而对细胞造成伤害，致使细胞之死亡。细胞活化后，约需数日，或继代一至二代，其细胞生长或特性表现才会恢复正常。 1材料：37℃恒温水浴箱，新鲜培养基，无菌吸管/离心管/培养瓶 步骤： 1、操作人员应戴防备面罩及手套，防备冷冻管可能爆裂之伤害。 2、自液氮或干冰容器中取出冷冻管，检查盖子是否旋紧，由于热胀冷缩过程，此时盖子易松掉。 3、取出冷冻管，立刻放入37C水槽中快速解冻，轻摇冷冻管使其在1分钟内全部融化。 4、常温离心1000rpm，5min，以70%酒精擦拭保存管外部，移入无菌操作台内，去除上清夜，加入新鲜培养基，重悬细胞。 5、取出细胞悬浮液，慢慢加入有培养基之培养瓶，混淆平均，放入CO2培养箱培养。 G418和筛选 1、筛选以前由于每种细胞对G418的敏感性不同，而且不同的厂家生产的相同浓度的G418的活性不尽相同，所以在筛选以前，一定要确定G418的最正确筛选浓度。 的配制：取1gG418溶于1ml1M的HEPES液中，加蒸馏水至10ml，过滤消毒，4度保存。 细胞培养：取待测培养细胞，制备成细胞悬液，按等量（10000个/ml）接种入24孔培养板中，留宿培养，开始加药。 制备筛选培养基：在100ug/ml～1000ug/ml范围内确定几个梯 度，比方先做个100ug/ml、200ug/ml、300ug/ml、400ug/ml。。。。 1000ug/ml，按梯度浓度用培养基稀释G418制成筛选培养基。 3 加G418筛选:吸除培养孔中培养基，PBS洗涤一次，每孔中加入不同浓度的筛选培养基。 换液：根据培养基的颜色和细胞生长情况，每3~5天改换一次筛选培养基。方法同4。 确定最正确筛选浓度：在筛选10～14天内能够杀死所有细胞的最小G418浓度即为最正确筛选浓度。一般400-８００左右，筛选时比该浓度再高一个级别，维持使用筛选浓度的一半。 2、确定了最正确筛选浓度后做稳定转染 1、转染：选用对数生长久细胞，接入平皿（4X105个/ml,5ml）,转染后培养24小时或许更长，到细胞增长靠近集合时按1：4密度传代，接入12孔板，持续培养，待细胞密度增至50％～70％集合。 2、加G418:去掉培养液，PBS洗一次，加入按最正确筛选浓度配制好的G418筛选培养基。 3、换液：根据培养基的颜色和细胞生长情况，每3~5天改换一次 筛选培养基。当有大量细胞死亡时，能够把G418浓度减半维持筛选。筛选10～14天后，可见有抗性的克隆出现，停药培养，待其渐渐增大。 4、挑单克隆：显微镜下察看单克隆，加入胰酶消化，将单克隆吸入96孔板（每孔接1个克隆），加培养液持续培养。待其渐渐增大后转入到48孔中增殖。（提早冻存） 5、单克隆判定：细胞大量扩增后，提取总RNA，做RT-PCR检测目的基因是否存在。 Lf2000转染：质粒DNA转染 转染前应筛选合适的DNA:Lf2000转染比率。一般按照1:1，2:1，3:1进行筛选。选择转染比率最高者为合适比率。筛选合适 的细胞集合度，看高集合度仍是低集合度转染效率高。筛选时注意察看最正确转染时间。 以下操作以24孔板为例： 1、贴壁细胞：转染前一天，去不含抗生素的培养液 4 500ul接于培养板(细胞密度个/ml)，转染时细胞交融可到 90-95%。 悬浮细胞：准备转染前取即可，取500ul细胞悬液（4-8X105 个/ml），培养液不含抗生素。 2、准备混淆物： A：将DNA稀释于50ulOpti中，轻柔混匀。 B：使用前轻柔混匀Lf2000，取合适剂量用50ulOpti稀释，室温放置20min(注意：到stepC时