蛋白质分离纯化.pptxVIP

研究蛋白质的结构、性质和活性蛋白质的功能，首先需要得到纯的、没有变性的蛋白质样品。 分离和纯化蛋白质的各种方法主要是利用蛋白质之间各种特性的差异，包括： 1.分子的大小和形状、 2.酸碱性质、 3.溶解度、 4.吸附性质 5.对配体分子的特异生物学亲和力。 ;第一节 蛋白质的酸碱性质 ; 蛋白质的等电点; 蛋白质的电泳;电泳;第二节 蛋白质分子大小的测定;常用测定方法：;一、根据化学组成测定最低相对分子质量 ;二、凝胶过滤法测定相对分子质量;;分子筛色谱 （凝胶过滤）;利用Andrews的实验经验式： logMr = a/b—Ve/bVo Ve（elution volume）为某一溶质组分的洗脱体积。它是自加样品开始到该组分的洗脱峰（峰顶）出现时所流出的体积。 V0 (outer volume)为外水体积，即存在于柱床中凝胶珠外孔隙的水相体积。测定出不能被凝胶滞留的大分子溶质如蓝色葡聚糖—2000的洗脱体积可以决定V0。 ;logMr;三、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定相对分子质量; 如果在聚丙烯酰胺凝胶系统中加入阴离子去污剂十二烷基硫酸钠(SDS)和少量巯基乙醇，单体蛋白质或亚基的多肽链处于伸展状态，此时SDS以其烃链与蛋白质分子的侧链结合成复合体。结果：1、所有的SDS-蛋白质复合体都具有相同的荷质比。2、具有相同的构象。因此蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的相对分子质量，而与原来所带的电荷和分子形状无关。 ;; 在聚丙烯酰胺凝胶中由于引入凝胶的分子筛效应，电泳迁移率与多肽链分子量的对数有下列关系： log Mr = a—bμR 式中Mr为相对分子质量，a、b都是常数，μR是相对迁移率： μR = 样品迁移距离/前沿（染料）迁移距离;; 实验测定时，以几种相对分子质量标准物蛋白质的Mr的对数值对其μR值作图，根据待测样品的μR,从标准曲线上查出它的Mr。;最准确可靠的方法是超离心法（Svedberg于1940年设计）：蛋白质颗粒在25~50*104 g离心力作用下从溶液中沉降下来。;蛋白质分子量（M）与沉降系数（s）的关系;第三节 蛋白质的胶体性质 与蛋白质的沉淀 ;一、蛋白质的胶体性质 ;;;;;二、蛋白质的沉淀 ;在温和条件下，通过改变溶液的pH或电荷状况，使蛋白质从胶体溶液中沉淀分离。 在沉淀过程中，结构和性质都没有发生变化，在适当的条件下，可以重新溶解形成溶液，所以这种沉淀又称为非变性沉淀。 可逆沉淀是分离和纯化蛋白质的基本方法，如等电点沉淀法、盐析法和???机溶剂沉淀法等。;在强烈沉淀条件下，不仅破坏了蛋白质胶体溶液的稳定性，而且也破坏了蛋白质的结构和性质，产生的蛋白质沉淀不可能再重新溶解于水。 由于沉淀过程发生了蛋白质的结构和性质的变化，所以又称为变性沉淀。 如加热沉淀、强酸碱沉淀、重金属盐沉淀和生物碱试剂沉淀等都属于不可逆沉淀。;沉淀蛋白质的方法有以下几种： (1) 盐析法 ： 向蛋白质溶液中加人大量的中性盐(硫酸铵、硫酸钠或氯化钠等)，使蛋白质脱去水化层而聚集沉淀。盐析沉淀一般不引起蛋白质变性。当除去盐后，又可溶解。; (2) 有机溶剂沉淀法 极性有机溶剂(甲醇、乙醇或丙酮等)，因引起蛋白质脱去水化层以及降低介电常数而增加带电质点间的相互作用，致使蛋白质颗粒容易凝集而沉淀。; (3) 重金属盐沉淀法 (4) 生物碱试剂和某些酸类沉淀法 (5) 加热变性沉淀法 几乎所有的蛋白质都因加热变性而凝固。原因可能是由于热变性是蛋白质天然结构解体，疏水基外露，因而破坏了水化层，同时由于蛋白质处于等电点也破坏了带电状态（当处于等电点时）。 ; 少量盐类促进蛋白质的加热凝固。（豆腐）我国很早就创造了将大豆蛋白质的浓溶液加热并点入少量盐卤(含MgCl2)的制豆腐的方法，这是成功的应用加热变性沉淀蛋白质的一个例子。 ;点卤时，由于盐卤是电解质，它们在水里会分成许多带电的小颗粒——正离子与负离子，由于这些离子的水化作用而夺取了蛋白质的水膜，以致没有足够的水来溶解蛋白质。另外，盐的正负离子抑制了由于蛋白质表面所带电荷而引起的斥力，这样使蛋白质的溶解度降低，而颗粒相互凝聚成沉淀。这时，豆浆里就出现了许多白花花的东西了。盐卤里有许多电解质，主要是钙、镁等金属离子，它们会使人体内的蛋白质凝固，所以人如果多喝了盐卤，就会有生命危险。 ;第四节 蛋白质分离纯化的 一般原则 ; 分离纯化某一特定蛋白质的一般程序可以分为： 1、前处理 2、粗分级分离 3、细分级分离 ;;;如果所要的蛋白质主要集中在某一细胞组分，如细胞核、染色体、核糖体或可