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CXCL12 与 Jurkat 细胞相互作用的验证 1)Jurkat细胞液的准备 培养基：45ml RPMI 1640+5mlFBS+0.5mlP/S 细胞复苏 1. 将细胞从液氮罐中取出，立即放入 37℃水浴锅中温热直至完全融化为止，期间迅速摇动冻存 管，保证细胞受热均匀。此操作最好在 1min 内进行。 2. 擦干，喷 ，放入超净台。用 1ml枪头将细胞液加到 15ml 离心管中，离心，1000rpm ，5min。 3. 培养瓶中加入2ml 培养基。去除上清液，加入 1ml 培养基重悬，加入培养瓶中，摇匀。 若细胞数目较多，则加入 4ml 培养基，并用 1ml 培养基重悬。 4. 置于显微镜下观察，放入 37 度培养箱。 细胞换液 24h 后需更换一次培养基，去除残余的 DMSO，防止损伤细胞。 1、 将培养液移到 15ml 离心管中，离心，1000rpm 5min。培养瓶中加入 4ml 培养基。（具体依据 细胞数目） 2、 弃上清，用 1ml 培养基重悬，加入培养瓶。 细胞传代 1. 待细胞长满培养皿的 80~90%时，传代。 2. 将细胞液移到 15ml 离心管中，离心，1000rpm 5min。 3. 弃上清，用培养基重悬。 细胞的冻存 冻存前需更换 10ml 培养液！！ 6 6 1. 细胞处于对数生长期，饱满透亮，且数目达到每毫升（ml）3×10 -6×10 个即可冻存。（尽 量高） 2. 配制冻存液：DMSO：FBS：Medium=1:3:6 (DMSO放在细胞房显微镜旁的干燥器里，轻轻推开上盖即可) 3. 计数，将细胞液移到 15ml 离心管中，离心，1000rpm 5min。 4. 去除上清，加入配置好的冻存液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，然后分装于冻存管中，做好 标记。 5. 4℃冰箱 30min，-20℃冰箱 2h，-70℃冰箱过夜，即可放入液氮中保存。 实验前处理 1. 配制Buffer A：500ul HEPES+0.5g BSA+50ml HBSS (-)(-)。 即含10mM的HEPES和1% BSA的不含钙镁离子的HBSS。 2. 细胞计数 3. 离心，1000rpm，5min，弃上清。 4. 用1mlBufferA 重悬沉淀后，加入9mlBuffer A，离心， 细胞。 5 6 5. 重复上述步骤，使细胞数目达到5*10 ~1*10 #/ml。 2）铺板 1、配制2% BSA的PBS溶液，用45uM的过滤器抽滤。 2、用镊子夹取防水硅胶圈 (5 mm × 5 mm)，将其固定在细胞培养皿的 。 注意：光滑面和底板接触。 3、用镊子尾部轻轻刮实，排除垫圈中的气泡，注意不要碰到中间实验区域。 4、在培养皿外面底部，铺有垫圈的挖空部分，用黑色签字笔做上标记，以标记铺有分子的 区域。 5、空白组：取40 μl含有2% BSA的PBS，滴加于实验区段中，将小培养皿放入大培养皿中， 并在大培养皿中加入一层水，防止蛋白分子挥发。室温孵育1h。 6、实验组：取40 μl 10ug/ml CXCL12，滴加于实验区段中，其他操作同上。 7、用含有2% BSA的PBS 3次，洗板时需从角落悬空吸吹。移除垫圈，加入800 μl 2%BSA 整个板，室温下孵育1h，放入冰箱。 3） 腔实验 1、 组装 腔腔体。 用 喷洗分液室和垫圈。用药匙的末端沾取少许胶，涂在有机玻璃分液室外圈，使其与硅 胶垫圈紧密贴在一起。同时较长的 管一端和分液室的进液口相连，另一端和注射器相连， 较短的 管一端和分液室的出液口相连，另一端待会和细胞液相连。把