细胞培养及材料细胞毒性检测.pptxVIP

细胞培养及材料细胞毒性检测; Wilhelm Roux (1850-1924 );Alexis Carrel France Rockefeller Institute for Medical Research New York, NY, USA b、 1873d、 1944 ;器官培养 (Organ culture):将活体中整个器官或一部分器官取出,置于体外生存、生长并同时保持其一定的结构和功能特征。 组织培养 (Tissue culture):把活体的一小片组织(O、5～1立方毫米)置于底物上孵育,细胞自其周围移出并生长。 细胞培养(cell culture):把提取的组织用机械或消化的方法分散成单个细胞悬液,后进行培养,增殖。 ;细胞培养的优点;培养细胞与体内细胞的差异;体外培养细胞的生长类型;来源:由中胚层间充质组织起源的组织 如:真正的成纤维细胞 心肌,平滑肌,成骨细胞,内皮细胞 形态:似体内成纤维细胞的形态 胞体梭形或不规则三角形 胞质向外伸出2—3个长短不等的突起 中有卵圆形核; 生长特点: 排列成放射状,漩涡状 并不紧靠连成片, 细胞—细胞接触易断开而单独行动 ;培养细胞的生长和增殖过程;细胞培养的工作原则;3、细胞培养的基本条件;常用仪器与设备;细胞培养器材;√;基础培养基 80％～95％ 血清 5％～20％ 青、链霉素 各100U／ml ;天然培养基: 血清 血浆 组织提取液(如鸡胚和牛胚浸液) ;常用血清 胎牛血清、新生牛血清、小牛血清、兔血清、 马血清等 优质血清的标准 透明,淡黄色,无沉淀物,无细菌、支原体、 病毒污染。 血清的灭活(消除补体活性) 56℃ ,30 分钟。 血清的消毒:过滤除菌; ;抗生素溶液;主要作用: 水解与赖氨酸或精氨酸相连接的肽键,除去细胞间粘蛋白及糖蛋白,使贴壁细胞从瓶壁上脱落并使细胞分离。 常用浓度:0、25% 用无Ca2+、Mg2+的PBS缓冲液或D-Hank’s配制,用滤器过滤除菌。 消化时间: 用含血清培养液终止其对细胞的消化作用。 ;物 品; 贴附生长型细胞 必须贴附于底物才能生长的细胞。从形态上大体分为上皮细胞型及成纤维细胞型,还有一些难以确定其稳定形态的细胞。;得到细胞;接种数量为5×104～8×105个/ml。 传代密度太低,细胞容易死亡,表???出细胞在达到增长前有较长的滞留期。 培养液由于pH下降而呈现黄色,表明细胞差不多达到最大密度需要换液或进行传代培养。 假如是单层贴壁的细胞,等长满培养瓶表面,即可进行传代。;游离期 悬浮,胞质回缩,全部细胞变为圆球形。 吸附期 贴附底物,一般24小时内贴壁。 潜伏期 此时细胞有生长活动,基本无增殖。 细胞株潜伏期一般为6～24小时。 对数生长期 细胞数随时间变化成倍增长,活力最佳,最适合进行实验研究。 停止期(平台期) 细胞长满瓶壁后,细胞虽有活力但不再分裂。 机制:接触抑制、密度依赖性 ;细胞观察;细胞计数;细胞生长的指标;细胞活力测定;四唑盐(MTT)比色法 MTT比色法的原理: 活细胞中琥珀脱氢酶能将四唑盐还原成不溶干水的蓝紫色产物甲臢(formazan),并沉淀在细胞中,而死细胞没有这种功能。 二甲亚砜(DMSO)能溶解沉积在细胞中蓝紫色结晶物,溶液颜色深浅与所含的formazan量成正比。 甲臢染料在A570nm处产生吸收值,用酶标仪测定A值。;细胞培养的其他指标;细胞固定与染色;细胞污染;细菌污染;真菌污染;支原体污染;污染的控制;6、细胞冻存与复苏;慢冻快融;7、细胞的管理及保藏;细胞库的建立;感谢您的聆听！