基因工程的酶学基础.pptxVIP

第1页/共105页第一节 限制性核酸内切酶一、限制性核酸内切酶（Restriction endonuclease） 是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此处切割DNA双链的核酸内切酶。 第2页/共105页1. 来源主要来源于原核生物2. 性质内切酶即在核酸分子链的内部制造切口的酶。形成5’-P和3’-OH末端 3. 功能自我保护作用细菌的限制和修饰系统（R/M体系）第3页/共105页第4页/共105页（1）限制（Restriction限制性内切酶将侵入细菌体内的外源DNA进行分解，切成小片断。（2）修饰（Modification）细菌自身DNA的碱基被甲基化酶甲基化(修饰) ，不能被自身的限制性内切酶识别切割而保护。① Dam甲基化酶(DNA Adenine Methylase)GATC 腺嘌呤N6位置引入甲基② Dcm甲基化酶(DNA cytosine Methylase)CCAGG或CCTGG序列在第二个C上C5位置上引入甲基第5页/共105页（3）限制与修饰系统相关的三个基因① hsd R: 编码限制性内切酶这类酶能识别DNA分子上的特定位点，并将双链DNA切断② hsd M: 编码限制性甲基化酶这类酶使DNA分子特定位点上的碱基甲基化，即起修饰 DNA的作用。③ hsd S: 编码限制性内切酶和甲基化酶的协同表达作用是协同上述两种酶识别特殊的作用位点。第6页/共105页二、限制性内切酶的命名1973年H.O Smith和D. Nathans提议的命名系统，命名原则如下：用属名的第一个字母大写种名的前两个字母小写由3个字母形成的略语表示寄主菌的物种名，组成酶的基本名称。大肠杆菌（Escherichia coli）用Eco表示；流感嗜血菌（Haemophilus influenzae）用Hin表示第7页/共105页4. 如果酶存在于一种特殊的菌株中，则将该菌株名的第一个字母加在基本名称后，若酶的编码基因位于噬菌体（病毒）或质粒上，则用一个大写字母表示此染色体外遗传成分。如 Hind ：d菌株 EcoR ：抗药性R质粒 第8页/共105页5. 如果一种特殊的菌株内有几种不同的限制与修复系统，用罗马字母表示该菌株中发现某种酶的先后次序。 如Hind Ⅱ：d菌株中发现的第二个酶6. 所有的限制酶，除以上名称外还要冠以系统名称。限制性内切酶的系统命名为R，甲基化酶为M。如 R.Hind Ⅲ表示限制性内切酶 M.Hind Ⅲ 表示相应的甲基化酶实际应用中，R常被省略。第9页/共105页限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶的命名属名 种名 株名Haemophilus influenzae d嗜血流感杆菌d株H i n d III H i n d III同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶第10页/共105页三、限制性内切酶的类型目前已发现600多种限制性内切酶，分为三类。限制性核酸内切酶的分类分类依据1）依据识别序列与切割位点是否一致2）所需辅助因子分为三类：I型酶、II型酶、III型酶第11页/共105页1. Ⅰ型限制性内切酶的基本特性首先由M.Meselson和R.Yuan在1968年从大肠杆菌 B株和 K株分离的。如 EcoB EcoK（1） 识别序列未甲基化修饰的特异序列EcoB： TGA(N)8TGCT EcoK：AAC(N)6GTGC第12页/共105页（2）切割位点在距离特异性识别序列上游约1000—1500 bp处随机切开一条单链，两条链上的切点相距70~75bp，即末端为单链。Recognize sitecut1-1.5kb（3）辅助因子需ATP、Mg2+和SAM（S-腺苷甲硫氨酸）第13页/共105页I型酶：限制修饰系统酶异源多聚体，R、M、S分别为限制性内切酶、甲基化酶、特异位点识别的活性。识别序列全甲基化-不识别识别序列半甲基化-甲基化作用识别序列未甲基化-限制性内切酶作用识别序列与切割位点不一致，且切割位点随机不定ATP、Mg2+和SAM（S-腺苷甲硫氨酸）第14页/共105页2. Ⅲ型限制性内切酶 识别序列与切割位点不相一致切割位点相对固定反应需要ATP、 Mg2+和SAM（S-腺苷蛋氨酸）。EcoP1: AGACCEcoP15: CAGCAG在基因工程操作中用途不大。第15页/共105页2. Ⅱ类限制性内切酶的基本特性 识别双链DNA分子中4 - 8对碱基的特定序列大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧识别切割（一致）序列呈典型的旋转对称型回文结构EcoR I的切割位点EcoR I的识别序列5‘ … G C T G A A T T C G A G … 3’3‘ … C G A C T T A A G C T