蛋白质互作课件.ppt

蛋白质互作 2. 关于膜蛋白的研究 细胞膜受体之间相互作用: 外界 刺激因素向细胞内的信号传递一般认为通过其在胞膜上的 受体,当配体与受体结合后,引起受体构象变化或化学修饰， 介导信号传递。但是关于Fas及其同源物TNFR(均为胞膜 上的三聚体受体)的研究发现,它们都可以在无配体存在的情 况下自发组装,并介导信号传递,引发细胞凋亡。其中在鉴定 Fas发生三聚体化的实验中使用了FRET技术, 将Fas分别与 CFP和YFP融合,利用此项技术可以很方便地观测到Fas单体 是否发生聚合。 蛋白质互作 蛋白质互作 优点：免疫共沉淀、pull-down等技术需要破碎细胞，只能反映细胞群体的静态事件，FRET实现了单个活细胞PPI在体内实时动态的连续观测。 缺点：要求发色基团的距离小于100埃。另外设备昂贵，还需要融合蛋白标记。 蛋白质互作 蛋白质互作 ?该技术是将诱饵蛋白结合于葡聚糖表面，葡聚糖层固定于几十纳米厚的技术膜表面。当有蛋白质混合物经过时，如果有蛋白质同“诱饵〞蛋白发生相互作用，那么两者的结合将使金属膜表面的折射率上升，从而导致共振角度的改变。而共振角度的改变与该处的蛋白质浓度成线性关系，由此可以检测蛋白质之间的相互作用。 优点：该技术不需要标记物和染料，安全灵敏快速，还可定量分析。 缺点：需要专门的等离子表面共振检测仪器。 蛋白质互作 蛋白质互作 蛋白质互作 交联技术〔cross－linKing〕 蛋白质探针技术 噬菌体展示技术〔Phage display〕 生物信息学的方法（Docking 嵌合计算） 蛋白质互作 蛋白质互作 PPI的预测主要基于蛋白质数据库中已知的相互作用数据库，对PPI结构域的结构和识别序列等信息，通过相应算法，预测蛋白质间是否存在相互作用。 PDB (protein databank) PQS (protein quaternary structure) 天下难事必作于易，天下大事必作于细。 图难于其易，为大于其细。 天下难事必作于易，天下大事必作于细。 是以圣人终不为大，故能成其大。 夫轻诺必寡信，多易必多难。 是以圣人犹难之，故终无难矣。 蛋白质互作 蛋白质互作 蛋白质复合物空间结构的精细解析 X射线晶体衍射 核磁共振波谱 三维电镜重构技术 PPI的高通量研究 酵母双杂交 亲和纯化联合质谱技术 蛋白质互作 蛋白质互作 蛋白质相互作用的类型：牢固型互作和暂时型互作两种。互作力既可以强，也可以弱。 牢固型互作：以多亚基蛋白复合体常见，可以通过免疫共沉淀、Pull-down法研究。 暂时型互作：涉及到胞内大部分生物过程，包括蛋白折叠、修饰、转运、信号转导和细胞周期等。 蛋白质互作 蛋白质互作 酵母双杂交筛选系统 蛋白质亲和色谱 Pull-down 技术 免疫共沉淀 细胞免疫荧光染色 荧光共振能量转移〔FRET〕 表面等离子共振 蛋白质互作 (一) 酵母双杂交技术 一种基因筛选策略：蛋白质之间微弱的、瞬间的作用也能够通过报告基因的表达产物敏感地检测得到 。 酵母双杂交系统利用杂交基因通过激活报告基因的表达探测蛋白－蛋白的相互作用。 用于活细胞体内的蛋白质之间的相互作用研究。 简便、快速地分离到新的互作蛋白。 蛋白质互作 蛋白质互作 原理基于真核细胞转录因子的结构特殊性，这些转录因子通常需要两个或以上相互独立的结构域组成。分别使结合域和激活域同诱饵蛋白和猎物蛋白形成融合蛋白，在酵母细胞中表达，如果两种蛋白可以发生相互作用，则可使结合域和激活域在空间上充分接近，从而激活报告基因。 酵母的转录因子GAL4 GAL4由功能上相互独立的结构域构成，DNA结合功能域(DNA binding domain，DBD)和转录激活结构域〔activation domain，AD〕。只有当被分开的两者通过适当的途径在空间上较为接近时，才能重新呈现完整的GAL4转录因子活性，使启动子下游基因得到转录。 蛋白质互作 酵母双杂交 蛋白质互作 蛋白质互作 1. 作用信号是在融合基因表达后， 在细胞内重建转录因 子的作用而给出的， 省去了纯化蛋白质的繁琐步骤。 2. 检测在活细胞内进行， 可以在一定程度上代表细胞内 的真实情况。 3. 检测的结果可以是基因表达产物的积累效应， 因而可 检测存在于蛋白质之间的微弱的或暂时的相互作用。 4. 酵母双杂交系统可采用不同组织、器官、细胞类型和 分化时期材料构建cDNA文库， 能分析细胞浆、细胞 核及膜结合蛋白等多种不同亚细胞部位及功能的蛋白。 蛋白质互作 蛋白质互作 ??自身有转录功能的蛋白会造成假阳性。融合蛋白会影响蛋白的真实结构和功能。不利于核外蛋白研