基因诊断与基因治疗.pptVIP

基因重组 ——是指DNA片段在细胞内、细胞间，甚至在不同物种之间进行交换，交换后的片段仍然具有复制和表达的功能。 广泛的分为三个水平： 整体水平（如 生物有性杂交） 细胞水平（如 单克隆抗体技术） 分子水平（如 构建重组体） 一、重组DNA技术相关概念 克隆(clone) 来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。 获取同一拷贝的过程称为克隆化(cloning)，即无性繁殖。 （一） DNA克隆 技术水平：分子克隆(即DNA 克隆 ) 细胞克隆 个体克隆（动物或植物）　 应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质（同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工的DNA）与载体DNA接合成一具有自我复制能力的DNA分子——复制子(replicon)，继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增提取获得大量同一DNA分子，也称基因克隆或重组DNA (recombinant DNA) 。 定义 DNA克隆 生物技术工程: 基因工程、蛋白质工程、酶工程、细胞工程等 目的 ① 分离获得某一感兴趣的基因或DNA ② 获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质） 基因工程(genetic engineering) —— 实现基因克隆所用的方法及相关的工作称基因工程，又称重组DNA工艺学。 （二）工具酶 限制性核酸内切酶 DNA聚合酶Ⅰ 逆转录酶 T4DNA连接酶 碱性磷酸酶 末端转移酶 Taq DNA聚合酶 重组DNA技术中常用的工具酶 工 具 酶 功 能 限制性核酸内切酶 识别特异序列，切割DNA DNA连接酶 催化DNA中相邻的5′磷酸基和3′羟基末端之间形成磷酸二酯键，使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接 DNA聚合酶Ⅰ 合成双链cDNA分子或片段连接 缺口平移制作高比活探针 DNA序列分析 填补3′末端 Klenow片段 又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的5??3?聚合、3??5?外切活性，而无5??3?外切活性。常用于cDNA第二链合成，双链DNA 3?末端标记等 反转录酶 合成cDNA 替代DNA聚合酶I进行填补，标记或DNA序列分析 多聚核苷酸激酶 催化多聚核苷酸5′羟基末端磷酸化，或标记探针 末端转移酶 在3′羟基末端进行同质多聚物加尾 碱性磷酸酶 切除末端磷酸基 限制性核酸内切酶 (restriction endonuclease, RE) 限制性核酸内切酶:是识别DNA的特异序列, 并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。 GGATCC CCTAGG G CCTAG GATCC G + Bam HⅠ 定义 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 基因工程技术中常用Ⅱ型， 特点是识别位点与切割位点一致 分类 与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统，限制外源DNA， 保护自身DNA。 作用 第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写； 第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写； 第四个字母代表株； 用罗马数字表示发现的先后次序。 命名 Hin dⅢ 属 系 株 序 Haemophilus influenzae d株 流感嗜血杆菌d株的第三种酶 Ⅱ类酶识别序列特点—— 回文结构(palindrome) 切口 ：平端切口、粘端切口 GGATCC CCTAGG Bam HⅠ GTC CAG G CCTAG GATCC G + GGATCC CCTAGG HindⅡ GTCGAC CAGCTG GAC CTG + 平端切口 粘端切口 钝性末端 粘性末端 （三）转导作用 当病毒从被感染的（供体）细胞释放出来、再次感染另一（供体）细胞时，发生在供体细胞与受体细胞之间的DNA转移及基因重组即为转导作用(transduction)。 λ噬菌体的生活史 溶菌生长途径 (lysis pathway) 溶源菌生长途径 (lysogenic pathway) 例 溶源生长途径（整合途径）：噬菌体整合进宿主细菌染色体，随宿主菌DNA复制而复制。 溶菌生长途径（裂解途径）：噬菌体DNA在宿主菌内迅速复制，溶解细菌，产生新生噬菌体。 转染：是特殊形式的转化，是离体状态的完整的病毒噬菌体DNA/RNA感染受体菌而引起的后者遗传型和表型发生的变化 当病毒从被感染的（供体）细胞释放出来、再次感染另一（供体）细胞时，发生在供体细胞与受体细胞之间的DNA转移及基因重组即为转导作用。 三、位点特异重组 位点特异重组(site-