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工程大肠杆菌高效转化外源脂肪酸生成羟基脂肪酸的研究 　　摘要：细胞色素p450单加氧酶（p450bm3）能特异性催化脂肪酸ω碳位羟基化反应生成羟基脂肪酸，在前期构建携带单加氧酶基因p450bm3工程大肠杆菌（escherichiacoli）转化脂肪酸的基础上，为解决外源脂肪酸在羟基化过程中的消耗和转运问题，构建了脂酰基辅酶a合成酶基因（fadd）缺失和外膜蛋白编码基因（fadl）过表达的工程菌株。摇瓶条件下羟基十二酸产量达到748.8mg/l，转化率为93.6%。 　　关键词：脂酰辅酶a合成酶;外膜蛋白编码基因;羟基脂肪酸;重组大肠杆菌（escherichiacoli） 　　中图分类号：ts206.4文献标识码：a 　　文章编号：0439-8114（2020）01-0152-04 　　doi：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2020.01.035开放科学（资源服务）标识码（osid）： 　　abstract：cytochromep450bm3canhydroxylatesfattyacidsintohydroxyfattyacids（hfas）attheω-positionswithhighentioselectivity.basedontheconstructionofescherichiacolicarryingp450bm3genetotransformfattyacids.asanefforttosolveinhibitfattyacidβ-oxidationandincreaseoutermembranefattyacidstransporter，thelipoacyl-coasynthasegene（fadd）deletionandoutermembraneproteinsencodegene（fadl）overexpressionstrainswerebuilt.undershake-flaskconditions，thisrecombinantstrainsproduced748.8mg/lhydroxydodecanoicacid，meanwhiletheconversionratewas93.6%. 　　keywords：lipoacyl-coasynthasegene（fadd）;outermembraneproteinsencodegene（fadl）;hydroxyfattyacid;recombinantescherichiacoli 　　羥基脂肪酸是合成假神经酰胺、聚酯以及内酯的重要前体[1-3]，其中，ω-羟基脂肪酸由于羟基位于首位碳链端，可为聚合物材料合成提供最长碳链，是生物可降解材料研究开发中最理想的原料之一[4-6]。由于传统化学合成的局限性，微生物合成羟基脂肪酸已成为近年来的研究热点[7]。 　　微生物转化脂肪酸合成羟基脂肪酸具有转化效率低的特点[8]，为提高外源脂肪酸转化率和羟基脂肪酸产量，引入增加胞外脂肪酸转运量和降低菌体β氧化途径的策略，通过敲除脂酰基辅酶a合成酶基因（fadd）阻断脂肪酸β氧化途径[9，10]，以增加底物脂肪酸浓度;过表达大肠杆菌（escherichiacoli）外膜蛋白编码基因（fadl），增大外源脂肪酸转运量[11，12]。通过对重组菌发酵条件的优化，有效提高了外源脂肪酸转化率和ω-羟基脂肪酸产量。 　　1材料与方法 　　1.1材料 　　1.1.1菌株、质粒和引物escherichiacolibl21（de3）和escherichiacolidh5α，invitrogen公司;菌株bacillusmegaterium14581、escherichiacolik-12、质粒pet-28a（+）和pacycduet-1，novagen公司。 　　工程菌escherichiacolibl21（de3）+pacycduet-1-p450bm3记作wx1;escherichiacolibl21（de3）△fadd+pacycduet-1-p450bm3，记作wx2;escherichiacolibl21（de3）△fadd+pacycduet-1-p450bm3+pet-28a（+）-fadl，记作wx3。3种工程菌株由山东大学（威海）海洋学院实验室构建并保藏。菌株wx1携带质粒pacycduet-1，质粒上携有脂肪酸羟化酶基因p450bm3，菌株wx2、wx3为fadd基因敲除型，质粒pet-28a（+）携带fadl基因。本研究所用菌株、质粒及引物见表1。 　　1.1.2试剂与培养基pyrobestdna聚合酶、t4dna连接酶、