红细胞膜蛋白提取流程.pptxVIP

实验分组;一.红细胞膜提取制备（低渗法）;注意事项：;（1）RBC分离： 15 ml RBC液 2000rpm 5分钟 RBC（沉淀）＋3倍体积等渗磷酸Buffer 2000rpm 5分钟×2 洗净之RBC （2）溶血液制备 RBC加入低渗磷酸buffer（1:50) (在 烧杯中） 稍搅拌 置冰箱冻格（4?C）溶血过夜 （以上步骤已完成！！）;二、 RBC膜纯化（洗涤）;三、 样品处理： 1.SDS用样品处理（一大组）： 0.3ml RBC原液+0.3ml 样品溶解液 沸水浴 5’ 2.Lowry法测定用样品处理 (3-4 人/group）： A. 取0.3ml RBC原液＋ 1.5ml H2O＋ 150ul NaOH 沸水浴 5’ 待测管1： 取A液0.1ml＋0.9ml H2O 待测管2： 取A液0.3ml＋0.7ml H2O;四、Lowry法测定膜蛋白含量;作图： 横坐标以标准蛋白含量 纵坐标以A620吸光度值 图比例应为3:2（横：纵） 计算： 在标准曲线上查出待测样品的浓度，计算 提取膜的 Pr mg数/ml样品 注意稀释倍数 要求：计算原提取RBC液的Pr含量 ;五、SDS测定膜蛋白分子量;（一）垂直板安装 每套板两块玻璃下端对齐，夹好，放在胶架上！ （二）凝胶制备（见表） 先配好分离胶（留距齿梳1cm），待其凝固后，再配浓缩胶。 （三）电泳装置安装 先装内槽，试无渗漏； 放入外槽中，加Buffer。 上样品： 每孔18ul，2块/组 每块板留一标准蛋白孔 （四） 电泳： 100V进分离胶调至80V 约1.5小时 ;（五）取胶: 用专用板平面轻轻“橇”开板，推入小平皿中。 注意： 一块半干转移（浸入转移Buffer20min） 另一块考马斯亮蓝染色 染色2小时后，7%醋酸脱色（×4） 每组做好标记（写好名字），交生化室扫描或摄像保留。;分子量计算;;3.半对数图：（六条标准蛋白） （参照统计学散点法） 横坐标为迁移率MR 纵坐标为LogM （直接按每一蛋白分子量标在半对数图中） 4.计算待测样品蛋白质分子量： 选在标准蛋白迁移范围内的相应待测样品中的三条带，测量距离计算MR，Mw ;9 8 7 6 5 4 3 2 1;六、western blotting(β-actin鉴定);银 染;谢谢您的观看！