一种皮肤刺激体外替代新方法.docxVIP

介绍一种皮肤刺激体外替代新方法 在医疗器械生物学评价方面，皮肤刺激试验目前仍采用家兔法进行安全性试验，而运用减少（Reduction）、替代（Replacement）、优化（Refinement）动物试验的 3R 原则和采用动物试验替代方法进行安全评价，已成为欧洲社会努力实现的目标之一，皮肤刺激体外替代新方法EpiSkinTM、改良EpiDermTMSIT 和SkinEthicTMRHE 方法通过ECVAM（欧洲替代方法验证中心）大约10 年时间的验证，经历研究阶段? 发展阶段? 前期确认? 确认阶段? 多方专家独立回顾? 法规接受等阶段于 2010 年 7 月最终被OECD TG439 采纳用来代替家兔Draize 法来进行皮肤刺激试验。下面就简要介绍一下皮肤刺激体外替代新方法及其是如何被ECVAM 验证的。 体外重组人皮肤表皮模型，是法国欧莱雅集团经过 20 年研究， 从一些乳房整形手术中获得表皮角化细胞(Keratinocytes)，在铺满胶原质(collagen)培养器中培养两到三周，具有较强繁殖功能的角化细胞不断分化、成层，最终成长为类似于人类表皮的皮肤组织。 图 1 正常人皮肤表皮结构 图 2 体外重组人皮肤表皮结 构 它具有原始皮肤细胞典型的器官结构和超微结构，可以像真实皮肤一样不断生长，有皮肤屏障功能，在阳光下暴露一定的时间会变黑，能表现一些人逐渐变老的特征，甚至还可以表现人愤怒时的迹象，非常适合用于皮肤刺激体外替代试验，已经商品化的有EpiSkinTM、EpiDermTMSIT 和SkinEthicTMRHE 图 3 EpiskinTM标准试剂盒 其试验原理是将受试物均匀涂布于皮肤模型上，接触一定时间后用 MTT 法测试细胞存活率，若存活率≤50%提示有刺激性。皮肤刺激替代方法的发展历程 1998-2001 ECVAM 对EpiSkinTM、EpiDermTM、 Prediskin、non-perfused pig ear 和Skin Integrity Function Test (SIFT)的前期研究 2002-2003 对EpiSkinTM、EpiDermTM 和SIFT 进行优化 2003-2007 ECVAM 对EpiSkinTM、EpiDermTM 和 SIFT 进行验证 2008 ESAC 声明改良EpiDermTMSIT 和SkinEthicTMRHE 方法在欧 盟DSD 范围有效 2009 2009.7 ESAC声明EpiSkinTM、改良EpiDermTMSIT 和SkinEthicTMRHE 方法可以在联合国全球化学品统一分类和标签制度GHS 和欧盟化学品分类、标签和包装法规CLP 范围执行重组人皮肤表皮方法作为欧盟试验方法B.46 被接受 2010.7 OECD 采纳了试验指南TG439（体外皮肤刺激试验：重组 人皮肤表皮试验方法） ECVAM 对优化的试验方法的验证 第一阶段：优化草案和测试模型的确认（用20 种编码的化学物在顶尖实验室提前筛选）、皮肤模型审查、刺激物的选择和评估（可溯源）、参与实验室的培训。 表 1 EpiDermTM、 EpiSkinTM 和 SIFT 三种方法对比 灵敏度 特异性 准确度 EpiDermTM 56.0% 91.0% 75.0% EpiSkinTM 67.0% 91.0% 80.0% SIFT 22.0% 64.0% 45.0% 最终SIFT 由于灵敏度、特异性和准确度太低，被从优化草案中删除。 第二阶段：实验室内、实验室间测试方法的可重复性和可预见性评估，三个实验室各自用三种方法测试 58 种编码的化学物，每种方法循环测试 3 次。阳性对照和阴性对照必须符合测试标准要求（包括OD 值或是存活率），对不符合要求的测试可以用重复测试结果来代替，允许重复两次。实验室内重复性应该≥85%，实验室间重复性应该≥80%，可预见率（因测试方法的目的不同而不同，如果是完全代替则要求假阴性、假阳性≤30%），确保获得足够的分析数据，85% 以上的测试次数应该完成。 实验室内重复性实验室间重复表 2 EpiDermTM 和 EpiSkinTM 实验室内重复性 实验室间重复 性 EpiSkinTM 94.6% 94.6% 92.6% 88.0% EpiDermTM 98.2% 93.8% 93.8% 92.9% 表 3 EpiDermTM、 EpiSkinTM 和 EpiSkinTM （IL-1α 法）比较 确度 灵敏度 特异性 准 EpiSkinTM MTT 法 77.6% 72.0% 81.8% EpiSkinTM MTT +IL-1α 法 84.5% 92.0% 78.8% EpiDermTM MTT 法 75.9% 60.0% 87.9% 最终EpiSkin