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琼脂糖凝胶电泳的制备及核酸检测 实验二琼脂糖凝胶电泳的制备及核酸检测 一.实验目的 1、掌控琼脂糖凝胶电泳的原理; 2、学习琼脂糖凝胶电泳的操作。 溴化乙锭（eb）为扁平状分子，在紫外反射下升空荧光。eb可以与dna分子构成eb-dna复合物，其升空的荧光强度较游离状态eb升空的荧光强度小10倍以上，且荧光强度与dna的含量成正比。用肉眼观测，可以检测至5ng以上的dna。 1．影响dna在琼脂糖凝胶中迁移速率的因素： 1)dna分子大小 迁移速率u与logn成反比（n为碱基对数目）。分子大小相等，电荷基本相等（dna结构重复性）。分子越大，迁移越慢。等量的空间结构紧密的电泳快（超螺旋线性dna） 2)琼脂糖浓度：相同的凝胶浓度，辨别相同范围的dna agarose：0.5%：1-30kb； 0.7%：0.8-12kb 1.2%：0.4-7kb； 1.5%：0.2-3kb. 3)dna构象：一般迁移速率超螺旋环状线状dna单链开环 4)所提电压：低电压时，线状dna片段的搬迁速率与孔布龙电压成正比。并使辨别效果不好，凝胶上所提电压不应当少于5v/cm 5)碱基组成与温度：一般影响不大4-30℃ 6)内嵌染料的存有：减少线性dna迁移率，(不倡导提在电泳液中) 7)电泳缓冲液的组成及其离子强度影响dna的迁移率，无离子存在时，核酸基本不泳动，离子强度过大产热厉害，熔化凝胶并导致dna变性，一般采用1×tae，1×tbe，1×tpe（均含edtaph8.0）。 2．溴化乙锭（eb）为致癌剂，操作方式时应当穿手套，尽量减少台面污染。 3．电泳指示剂：核酸电泳常用的指示剂有两种，溴酚蓝呈蓝紫色；二甲苯晴呈蓝色，它携带的电荷量比溴酚蓝少，在凝胶中的的迁移率比溴酚蓝慢。 4、电泳缓冲液：taetbe tae与tbe不同之处在于tbe用硼酸代替了tae中的冰醋酸。 三、仪器和试剂 微量移液器，电泳仪，电泳槽，微波炉 琼脂糖：1.0%； 电泳缓冲液（50×tae电泳缓冲液取tris24.2g，冰醋酸5.7ml，0.25mol/ledta(ph8.0)20ml，加蒸馏水至100ml） eb：5μl/100mltbe 电泳材料：标准分子量核酸（dl2000） （1）制胶（以20ml为基准） a.称取0.2g琼脂糖，加入20ml的tae缓冲液（ph8.0），摇匀；b.微波炉加热，至琼脂糖完全溶解（要防止过热溢出三角瓶）； c.将新制胶板放进制胶槽中，填入适度的梳子，将熔化的琼脂糖（约50℃）重新加入2uleb后，搭光滑，放入其中，直到厚度为4～6mm（例如存有气泡必须把气泡赶着出来），在室温下加热凝结(约30~45min)； d.将制胶板置于电泳槽中，小心垂直向上拔出梳子，以保证点样孔完好。 用微量移液器将5μl含蓝色染液的dl2000重新加入点样孔下部。 打开电源开关，调节电压至3~5v/cm(约100v)，可见到溴酚蓝条带由负极向正极移动，约30-40分钟后即可观察结果。 将电泳不好的胶放在紫外反射检测仪上，关上紫外灯，可以看见橙红色核酸条带，根据条带厚薄，可以粗略估计该样品dna的浓度。例如同时存有未知分子量的标准dna展开电泳，则可以通过线性dna条带的相对边线初步估算样品的分子量。 五、实验结果与分析 1、存有条带跑完电泳后两边浓，中间较粗，很可能将就是由于点样时不光滑，两边点样较太少； 2、有条带跑完电泳后看不见，很可能是由于样品未加入点样孔，飘浮在电泳液里了 搞琼脂糖凝胶电泳应当特别注意哪些问题？ 1、加样时枪头不要碰坏凝胶壁，否则dna的带型将不会整齐，加样前要用枪头吸打凝胶孔中的溶液，以赶走样品空中的气泡。2、应注意每孔最大上样容量及样品孔体积，以免加样时样品流入附近样品孔造成交叉污染，影响结果分析。 3．分体式琼脂糖时应当并使其全然熔融后方可作胶。 4．琼脂糖凝胶易于破碎，操作时要轻缓。 5．电泳时应特别注意电源线路，防治窒息。 6．溴化乙淀具有致癌作用，配制及使用时应带乳胶或一次性塑料手套。并在专门的实验室内使用。 7．紫外线对人体存有受损促进作用，关灯时间不必太短，特别注意防水。