桑蚕微粒子病病原孢子检验鉴定方法.docxVIP

桑蚕微粒子病病原胞子检验鉴定方法 1范围本标准规定了桑蚕微粒子病病原的检疫和鉴定技术方法。 本标准适用于桑蚕的幼虫、蛹、蛾、卵（壳）及其排泄物、脱离 物，桑园的害虫、桑叶、水源、土壤及其环境尘埃等物质的桑蚕微粒 子病病原的检疫和鉴定。蒐麻蚕微粒子病病原的鉴定可参照本标准执 行。 2规范性引用文件 以下文件对于本文件的应用是必不可少的。但凡注日期的引用文 件，仅所注日期的版本适用于本文件。但凡不注日期的引用文件，其 最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 3术语和定义以下术语和定义适用于本标准。 3. 1桑蚕微粒子病 Mu I berry micro part i c I e d i sease 是由原生动物微粒子虫寄生在桑蚕体内而引起的一种疾病。 3. 2样本Samp I e 指按照一定的抽样规那么从总体中取出的一局部个体称样本。 3批次Batch 指在相同环境条件下同一时间收蚁的同一品种饲养的一个群 体，称为一个批次。 4试剂浓盐酸（HC1）。 分析纯氢氧化钾（KOH）（分析纯）。 无菌蒸储水5仪器、设备 生物显微镜。 生化培养箱（温控范围15℃?45℃；湿控范围60%?90%RH）。 5. 3冰箱。 天平（感量：0. 001g） o离心机。 载玻片。 盖玻片。 量筒。 研钵。 镇子。 11烧杯。 5.12移液管。 13滤网。 5.14采样袋。 6检验方法样本要求 每个样本要独立包装于采样袋中防止相互污染，已出现病害症 状的批次应尽可能对患病个体取样。 幼虫、蛹、蛾、蚕粪等容易腐烂变质的样本需烘干处理好后送 检，烘烤温度范围60℃?70℃,不宜用70℃以上高温烘烤，样本应 防鼠、防虫、防霉变。 送检样本上注明样本名称、来源、数量、采样地点、采样人及 采样日期等信息，并附送检清单。 样本收存样本接收后，应立即登记，编写检验号，将样本平均分成两份， 一份作为检样，另一份作为备检样。 将检样置于0℃?8℃冰箱中保存，以待检验。将备样装袋密封 后，置于-18℃保存1个月，如发现微粒子抱子，该样本至少需保存 3个月，以备复查。 样本检验将桑蚕幼虫、桑蚕蛹、桑蚕蛾、桑蚕卵（壳）、桑蚕排泄物、 桑蚕脱离物、桑园害虫等检样放入研钵孔中，加入适量1%?2%氢氧 化钾溶液，充分研磨后收集研磨液；将桑叶、桑园土壤、环境尘埃等 检样经水清洗后收集清洗液，将收集得到的研磨液或清洗液用滤网过 滤，过滤液经低速离心机3000r/min离心3iniri后，弃去上清液，加 1%?2%氢氧化钾溶液0.5?1ml于离心管中震荡Imin,于每支管中取2 滴样液，点于两块载玻片上制成临时标本，盖上盖玻片，用600倍显 微镜两人对检，每滴样液观察10个视野以上。假设两人检验结果不一 致或有微粒子抱子，须复查确认。 检样中脂肪球数量过多影响镜检效果时，应加入适量20%氢氧 化钾充分混匀，作用lOmin后再进行镜检观察。 镜检时有时会遇到畸形（多半是梨形或长形）抱子，往往易与 真菌狗子、细菌、酵母菌抱子或其他类似物相混淆，可用盐酸处理, 进行鉴别诊断。取可疑检样液2滴，分别滴于载玻片上，待自然干燥 后在其中一点加一滴浓盐酸（比重1.15）,另一点加无菌水作对照， 在27℃生化培养箱中放置10min-20min后，盖上盖玻片，用600倍 显微镜镜检。经盐酸处理，假设为微粒子抱子即溶解消失，假设为真菌抱 子、细菌和酵母菌抱子等类似物，仍保持原状。 7 Z吉果判定 显微镜下发现有抱子呈椭圆形、卵圆形、梨形，大小为（2.9 口 m-4.1 P m） X （1.7 u m-2.1 u m）,具有强折光性，呈淡绿（蓝）色， 在标本液中下层，镜检观察可以看到其上下摆动或随水滚动等特征, 那么判定其为微粒子抱子；或者盐酸作用后，被溶解的抱子判定其为微 粒子抱子（桑蚕微粒子抱子图见附录A）。 附录A （规范性附录）桑蚕微粒子泡子图 图A. 1桑蚕微粒子抱子图（放大600倍）