软枣猕猴桃品种鉴别技术规程SSR分子标记法.pdfVIP

DB ××/T ××××—2021 软枣猕猴桃品种鉴别技术规程 SSR 分子标记法 1 范围 本文件规定了利用简单重复序列（Simple sequence repeats，SSR ）分子标记法对软枣猕猴桃（Actinidia arguta(Sieb.Zucc)Planch.ex Miq. ）材料进行鉴别过程中样品准备、DNA提取、PCR扩增、PCR扩增产 物检测、指纹比对、数据记录、结果判定等方面的技术要求。 本文件适用于SSR分子标记技术构建软枣猕猴桃资源DNA指纹图谱过程中DNA分子数据采集和鉴 别。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T19557.1 植物新品种特异性、一致性和稳定性测试指南 总则 LY/T 2745仁用杏品种鉴定技术规程 SSR分子标记法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 PCR 指聚合酶链反应（polymerase chain reaction ，PCR)，是利用一段DNA为模板，在DNA聚合酶和核 苷酸底物共同参与下，将该段DNA扩增至足够数量，以便进行检测分析。 3.2 SSR 分子标记 SSR molecular marker 又称微卫星标记，由于每个简单重复序列两端的序列是高度保守的单拷贝序列，因而可根据两端的 序列设计特异性引物，利用PCR技术对两条引物间的DNA重复序列进行扩增，通过电泳可以区分不同 大小的扩增产物片段，经荧光染料标记加以区分。 3.3 待检样品 test sample 待鉴别的软枣猕猴桃样品，由送检人提供。 3.4 对照样品 control sample 1 DB ××/T ××××—2021 用于与待检样品进行指纹比对的样品，由送检人提供。 3.5 核心引物 core primer 扩增产物具有高度的稳定性和一致性（无干扰谱带），并具有较强的鉴别能力，可以用于建立软枣 猕猴桃比对的人工合成引物。 3.6 SSR 指纹图谱 SSR fingerprint 采用SSR核心引物（或相当于核心引物）扩增出的待检样品和对照样品的DNA片段，通过毛细管电 泳，得到不同大小的DNA片段图谱。 3.7 指纹对比 fingerprint comparison 将待检样品与对照样品的SSR指纹图谱进行比对，分析待检样品与对照样品的SSR指纹是否具有差 异，并确定其大小。 4 测试准备 4.1 仪器设备与主要试剂、耗材 仪器设备与主要试剂、耗材参见附录A 。 4.2 溶液配制 溶液配制方法参见附录B 。 4.3 核心引物 核心引物信息参见附录C 。 4.4 样品准备 依据NY/T 2324 中样本采集的技术规定进行样本采集，3次以上重复。取无病虫害的健康的芽，做 好标记后，蒸馏水清洗后-80℃保存。 5 DNA 提取 a ）将样品倒入研钵中，加入液氮研磨2次，约取0.1 mL放入1.5 mL离心管； b ）加入900 μL 2.5 %CTAB提取液，65℃水浴60 min，每10 min颠倒，混匀； c ）10000 r•min-1离心1 min，取上清650 μL，加650 μL氯仿∶异戊醇（24:1 ）混合液，混匀； d ）10000 r•min-1离心5 min，取上清400 μL，加入800 μL无水乙醇，-20 ℃放置30 min ； e ）5000 r•min-1离心1 min后倒掉上清液，用70 %乙醇洗3次，自然风干，再用50 μLTE溶解，置于4 ℃ 备用或保存； f ）用琼脂糖凝胶电泳法检测DNA提取质量，要求电泳条带清晰明亮； 2 DB ××/T ××××—2021 g ）用紫外分光光度法测定纯度和浓度，OD260/OD280 比值范围在1.7~1.9之间即为可用DNA样品， 将其最终质量浓度调至20 ng •μL-1 。 6 PCR 扩增 6.1 PCR 反应体系 总体积为20 μL，其中6.0 μL