牙膏中α－淀粉酶活力的定量测定方法.pdfVIP

QB/TXXXXX—XXXX 附 录 A （规范性） 牙膏中α－淀粉酶活力的定量测定方法 A.1 原理 利用α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶能水解底物[4,6-亚乙基(G )-p -硝基苯基(G1)-α,D-麦芽庚糖苷（亚乙基 7 -G PNP）]形成葡萄糖和黄色对硝基苯酚。生成对硝基苯酚的比率能够被全自动生化分析仪检测到，从 7 而反映出反应速率，依此定量计算出酶的活力。 A.2 试剂 A.2.1 α－淀粉酶（α－Amylase）标准品 A.2.2 反应底物：4,6-亚乙基(G)-p-硝基苯基(G1)-α, D-麦芽庚糖苷（亚乙基-GPNP）7 7 A.2.3 α－糖苷酶（α－glucosidase） A.2.4 二水合氯化钙（CaCl·2HO）：CAS号10035-04-82 2 A.2.5 亚硫酸钠（NaSO ）：CAS号7757-83-7 2 3 A.2.6 三聚磷酸五钠（NaPO ）：CAS号7758-29-4 5 3 10 A.2.7 聚氧乙烯月桂醚溶液（30%质量体积比）：CAS号9002-92-0 A.2.8 聚乙二醇叔辛基苯基醚（曲拉通X-100）：CAS号9002-93-1 A.2.9 15%(质量体积比) 聚氧乙烯月桂醚溶液 称取508g 聚氧乙烯月桂醚到烧杯中（不易溶解时，可置于35℃~45℃水浴中加热助溶），加入约 300mL超纯水搅拌，定量转移到 1L容量瓶中，用超纯水定容至刻度，搅拌均匀。4℃冰箱可存储2 个 月。 A.2.10 0.25%(质量体积比)聚氧乙烯月桂醚溶液 量取约600mL超纯水到烧杯中，少量多次加入441g二水合氯化钙（A.2.4）搅拌至完全溶解，冷却 至室温定量转移到1L容量瓶中。加入16.5mL15%(质量体积比)聚氧乙烯月桂醚溶液，冷却后用超纯水 定容至刻度，搅拌均匀。4℃冰箱可存储7天。 A.2.11 0.05%(质量体积比)聚乙二醇叔辛基苯基醚溶液 称取5g 聚乙二醇叔辛基苯基醚（A.2.8）到烧杯中，加入约100mL去离子水搅拌，定量转移到10L 容量瓶中。加入9500mL去离子水搅拌约10min至完全溶解。 称取100g 亚硫酸钠（A.2.5）和50g 三聚磷酸五钠（A.2.6），加到上述容量瓶中搅拌至完全溶解， 用去离子水定容至刻度。室温下可存储3天。 A.2.12 样品缓冲液 量取1mL0.25%(质量体积比)聚氧乙烯月桂醚溶液至1L容量瓶中，用0.05%(质量体积比)聚乙二醇 叔辛基苯基醚溶液定容，搅拌均匀。室温下可存储24h。 A.3 仪器与设备 A.3.1 全自动生化分析仪：要求带有进样/搅拌系统、温度控制系统和检测系统。检测系统要求在405 nm下检测吸光度的变化率。 A.3.2 分析天平：精度0.1mg。 A.3.3 pH计：精度为0.01。 A.3.4 磁力搅拌器：功率不小于500W。 A.3.5 天平：精度为0.01g。 4 QB/TXXXXX—XXXX A.3.6 离心机：转速大于12000 r/min。 A.4 测定步骤 A.4.1 标准曲线的测定 称取0.4937gα－淀粉酶标准品至250mL容量瓶中，用样品缓冲液定容至刻度，搅拌15～30min。室 温下可存储24h。 进一步稀释标准品的浓度，取1mL上述溶液至250mL容量瓶中，用样品缓冲液定容至刻度，得到标 准储备液。需立即使用。 将反应底物亚乙基-G PNP，α－糖苷酶以及标准储备液，各自转移至样品杯，按照顺序置于全自动 7 生化分析仪中，进行测试。标准曲线为5个点的标准曲线，最高点和最低点的浓度比为6.0，如表A.1所 示。