诺唯赞试剂说明书 传统TA克隆 pUM19-T Simple Vector.pdfVIP

pUM19-T Simple Vector C403-01/02/03 Version 5.1 Vazyme biotech co., ltd. 产品简介 pUM19-T Simple载体是一种高效克隆PCR产物(TA Cloning)的专用载体。它是在线性化pUC19载体的基础上，去除多克隆酶切位点，并在 两侧的3’端添加碱基T而制成。特殊的纯化方式使得超过99%的pUM19-T Simple载体两端都具有3’-T突出端，因此极大的降低了载体自连 率。由于去除了多克隆位点，克隆至pUM19-T Simple载体的目的片段需通过在PCR引物上引入酶切位点来进行亚克隆。由于大部分耐热 聚合酶反应时都会在PCR产物的3’端添加一个A ，可与pUM19-T Simple载体3’端的T互补连接，因此可显著提高PCR产物的连接和克隆效 率。可以通过蓝白斑快速筛选含有插入片断的重组子。连接使用的PCR片段3’端应带有A末端；PhantaTM Super-Fidelity DNA Polymerase (P501-d1/d2/d3)等高保真聚合酶的扩增产物不带A ，应先在其末端加A后再进行TA克隆。本品随载体提供对照片段(500 bp)用于阳性对照反应。 产品组成 组 分 C403-01 1 µg C403-02 5 µg (C403-01 × 5) C403-03 10 µg (C403-01 × 10) pUM19-T Simple Vector (50 ng/μl) 20 μl 100 μl 200 μl 500 bp control insert (50 ng/μl) 20 μl 20 μl 20 μl 储存条件 -20℃保存，避免多次反复冻融，可将载体和对照片段分装成小份后保存。 使用方法 1.将载体置于冰上融化。建议第一次使用时将载体分装成小份保存，每次取一支使用。 2.按下表配制连接反应体系 ddH O To 10 μl 2 10 × Ligase Buffer 1 μl pUM19-T Simple Vector (50 ng/μl) 1 μl (约0.025 pmol) * 0.075 pmol～0.25 pmol T4 DNA Ligase (400 U/μl) 1 μl *插入片段与载体的摩尔比应在3:1～10:1之间。请根据琼脂糖凝胶电泳或紫外分光光度计检测确定插入片段的浓度，并根据其大小计算摩尔量。1 pmol 1 kb双链DNA的质量约为660 ng。 3.对照反应体系 (可选) ： ddH2O 6 μl 10 × Ligase Buffer 1 μl pUM19-T Simple Vector (50 ng/μl) 1 μl (0.025 pmol) 500 bp control insert (50 ng/μl) 1 μl (0.15 pmol) T4 DNA Ligase (400 U/μl) 1 μl 4. 轻轻吹打混匀反应体系，室温22-26℃孵育1-2小时，或16℃过夜。 5.转化： 1)将连接产物加入100 μl感受态细胞中(连接产物体积不要超过感受态细胞体积的1/10)，轻轻弹匀，冰上孵育30分钟。 2)将离心管置于42℃水浴