目的基因的分离与克隆.pptx

目的基因的分离与克隆;质粒载体;基因工程原理纲要;第五讲 目得基因得分离与克隆;第一节 基因组DNA片断化;由于带有粘性末端,产物可以直接与载体连接。;二、随机片断化;1)4bp得内切酶;2、 机械切割法;1967年H、G、 Khorana提出了用化学方法合成基因得设想,并于1979年在Science上发表了率先成功地合成大肠杆菌酪氨酸tRNA基因得论文。; 将某种生物细胞得整个基因组DNA切割成大小合适得片断,并将所有这些片断都与适当得载体连接,引入相应得宿主细胞中保存与扩增。 理论上讲,这些重组载体上带有了该生物体得全部基因,称为基因文库。;大家学习辛苦了，还是要坚持;(2)目前常用得载体 ;断点完全随机,片断长度合适于载体连接。不能用一般得限制性内切酶消化法。;(2)载体与基因组DNA大片段得连接;各种酶得接头可以向公司定做或购买。;;4、 基因组文库得大小;;1、 cDNA;(1)不含内含子序列。 (2)可以在细菌中直接表达。 (3)包含了所有编码蛋白质得基因。 (4)比DNA文库小得多,容易构建。;分离mRNA用商业化得Oligo dT纤维柱。 ;;反转录酶;用碱处理或用RNase H降解mRNA-DNA杂交分子中得mRNA。;;;;这种酶能识别mRNA-cDNA杂交分子中得mRNA,并将其降解成许多小片断。;;;在双链cD