植物多糖分离纯化方案.pptxVIP

会计学 1 植物多糖分离纯化方案 色谱层析 色谱分析法、层析法，是一种分离和分析方法，现代生物企业生产过程中的核心技术之一。在分析化学、有机化学、生物化学等领域有着非常广泛的应用。色谱法利用不同物质在不同相态的选择性分配，以流动相对固定相中的混合物进行洗脱，混合物中不同的物质会以不同的速度沿固定相移动，最终达到分离的效果。 第1页/共23页 点击添加文本 点击添加文本 点击添加文本 点击添加文本 粗多糖提取 将所用的植物制品粉碎、过筛、烘干 加20倍体积蒸馏水，60~80℃水浴回流提取4~6 h 离心(5 000×g，10 min) 【取两滴上清液，稀释后加入4 ml 0．1％蒽酮．硫酸溶液，沸水浴7 min，呈现绿色，说明其中含有糖。再取上清液滴于滤纸上喷0．25％茚三酮试液 ，加热后立即呈紫红色，说明其中含有蛋白质，需要除蛋白。】 取上清，70°C减压浓缩 加3倍体积95％ 乙醇沉淀，至醇含量在80％以上，不断搅拌 离心收集沉淀，将沉淀置于布氏漏斗中，分别用无水甲醇、丙醇和乙醚洗涤，以除去水分和杂质 冷冻干燥，得粗多糖 第2页/共23页 点击添加文本 点击添加文本 点击添加文本 点击添加文本 植物多糖的提取 多糖不同的植物中，有着不同的含量和贮存位置，因此针对不同的植物有着不同的分离方法。 第3页/共23页 生物酶提取法 酸碱提法 点击添加文本 点击添加文本 点击添加文本 点击添加文本 部分沉淀法 溶剂提取法 甲醇分级沉淀法 季铵盐沉淀法 水提法 金属盐沉淀法 第4页/共23页 水提法 水对植物组织的穿透力强，提取效率高，在生产上使用安全、经济。用水作溶剂来提取多糖时，可以用热水浸煮提取，也可以用冷水浸提。一般植物多糖提取采用热水浸提法，该法所得多糖提取液可直接或离心除去小溶物；或者利用多糖不溶于高浓度乙醇的性质，沉淀提纯多糖；但由于不同性质或不同相对分子质量的多糖沉淀所需乙醇浓度不同，它也可以用于样品中不同多糖组分的分级分离；还可按多糖不同性质在粗分阶段利用混合溶剂提取法对植物中不同的多糖进行分离；其中，以乙醇沉淀最为普遍。但以根茎为主的植物体,细胞壁多糖含量高,热水直接提取率不高。此时为破坏细胞壁,增加多糖的溶出，有两种处理方法:一为酶解,二为弱碱溶解。 第5页/共23页 水提法 加水比对多糖提取的影响 第6页/共23页 酸碱提法 有些多糖适合用稀酸提取，并且能得到更高的提取率。但酸提法只在一些特定的植物多糖提取中占有优势，目前报道的并不多。而且即使有优势，在操作上还应严格控制酸度，因为酸性条件下可能引起多糖中糖苷键的断裂。   有些多糖在碱液中有更高的提取率，尤其是提取含有糖醛酸的多糖及酸性多糖。采用的稀碱多位为0．1mol／L氢氧化钠、氢氧化钾，为防止多糖降解，常通以氮气或加入硼氢化钠或硼氢化钾。同样，碱提优势也是因多糖类的不同而异。与酸提类似，碱提中碱的浓度也应得到有效控制，因为有些多糖在碱性较强时会水解。另外，稀酸、稀碱提取液应迅速中和或迅速透析，浓缩与醇析而获得多糖沉淀。 第7页/共23页 生物酶提取法 酶技术是近年来广泛应用到有效成份提取中的一项生物技术，在多糖的提取过程中，使用酶可降低提取条件，在比较温和的条件中分解植物组织，加速多糖的释放或提取。此外，使用酶还可分解提取液中淀粉、果胶、蛋白质等的产物，常用的酶有蛋白酶，纤维素酶，果胶酶等。 第8页/共23页 金属盐沉淀法 提取液中加入中性醋酸铅可沉淀去除大部分酸性、酚性的杂质（如有机酸、氨基酸、蛋白质、树脂酸、黄酮、蒽醌、鞣质等），包括酸性多糖。而用碱式醋酸铅对多糖的沉淀就更为完全。除去杂质后的母液用H2S脱盐后，单糖、低聚糖和水溶性较大的中性苷类仍保留在滤液中。铅盐沉淀法除去杂质比较完全，母液脱铅后可用于单糖和低聚糖的定量，也可用铜盐沉淀法提取多糖。 第9页/共23页 季铵盐沉淀法 季铵类氢氧化物是一类乳化剂，可与酸性糖形成不溶性沉淀，常用于分离酸性多糖。季铵氢氧化物与中性多糖不生成沉淀，但当调高PH，使某些OH基解离，或加硼酸缓冲液增高糖的酸度，中性糖也能被沉淀。利用季铵氢氧化物在酸性、中性、微碱性、碱性中分级沉淀可以分离多糖。 第10页/共23页 甲醇分级沉淀法 常用的分级沉淀法是在混合多糖的浓水溶液中（常在PH=7时），逐步加入乙醇，收集不同醇浓度下析出的沉淀。一般各次沉淀需经反复溶解后，再醇析，直到测得的物理常数恒定，最常用的是旋光度测定和电泳检查。用分级沉淀法得到的多糖，常杂有较多的蛋白质，必须予以去除。一般选择那些使蛋白质沉淀而使多糖不沉淀的试剂来处理，如酚、三氯乙酸、鞣酸等。但必须处理时间短，温度低，避免多糖降解。 第11页/共23页 层析分离纯化 溶于最小体积水中，用Sevage法，5：1氯仿、正丁醇溶液以3OOO r／min离心20m