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PAGE PAGE 3 免疫学技术 实 验 指 导 目 录 第一章 抗原获取与抗体的制备 3 实验一实验二 免疫球蛋白的分离与纯化 4 动物免疫与佐剂制备 6 第二章 体外抗原抗体反应及其应用 8 实验三实验四实验五 凝集抑制试验—妊娠试验 9 双向琼脂扩散试验—免疫球蛋白鉴定 10 免疫电泳—免疫球蛋白鉴定 11 第三章 免疫标记技术 12 实验六 实验七实验八 荧光抗体标记 13 酶联免疫吸附试验（ELISA）—双抗体夹心法 .14 酶联免疫吸附试验（ELISA）—间接法 15 第四章 免疫细胞的检测 17 实验九 实验十 外周血单个核细胞的分离—密度梯度离心法 18 外周血 T 细胞的数量检测—E-花环形成试验 20 实验十一 淋巴细胞表面抗原检测—免疫荧光法 22 实验十二 细胞膜表面抗原检测—补体依赖的微量淋巴细胞 毒试验 23 实验十三 NK 细胞杀伤功能检测 25 第五章 细胞因子检测 26 实验十四 肿瘤坏死因子检测 27 附录：免疫学技术实验常用试剂配方 29 第一章 抗原获取与抗体的制备 在以抗原和抗体的特异性结合为基础的免疫学应用技术中，抗原的获取与抗体的制备构成了免疫应用技术的重要基础。 在经典的免疫学技术中，抗原的获取通常是指从复杂的有机体或多种混合组分 中分离出特定的抗原成分，以使被免疫机体的免疫应答局限化，提高反应的特异性。在此过程中通常使用的技术包括了组织分离与破碎、离心技术、各种层析以及以盐 析为代表的多种选择性沉淀技术。而在以半抗原制备免疫原的过程中，则还需涉及 到载体联接等生化反应技术。 在经典的抗体制备过程中，通常以免疫动物作为制备多克隆抗体的有效途径。这一过程牵涉到如何选择动物，怎样进行免疫接种和佐剂的制备使用等问题。而在 现代免疫学技术中以杂交瘤技术制备单克隆抗体，则更要依赖于细胞培养、细胞融 合、选择性培养和克隆化技术等许多实验方法。 因此，在抗原的获取与抗体的制备这一章中，牵涉到了许多有关生物化学、免疫学以及细胞生物学的技术。而掌握这些技术除了需要的学习外，更需要反复的实践。本章实验由于时间与各种条件的限制，仅能向同学们提供一个基本的概貌和一些力所能及的实验操作，希望通过理论与方法的介绍和初步的实验操作，同学们能举一反三，完成如下的学习要求： 掌握抗原纯化的目的意义及各类免疫原制备的原则。 掌握单克隆抗体制备与纯化的一般过程及方法原理。 掌握杂交瘤技术的基本原理 熟悉特异性抗体的制备过程 熟悉佐剂的原理与制备 了解免疫动物的基本方法及注意事项 实验一 免疫球蛋白的分离与纯化 一、原理 盐析法：利用蛋白质的胶体性质，在蛋白质溶液中加入一定量的中性盐类（如 424(NH4)2SO 、Na SO 等），使蛋白质脱水及降低颗粒表面电势，溶解度随之降低， 4 2 4 使蛋白质从溶液中析出，此即称为盐析作用。不同浓度的中性盐可分别将不同蛋 白质组分析出，达到分离之目的。沉淀（免疫）球蛋白的硫酸铵的最适饱和度为 33%。 凝胶过滤法：凝胶柱是以多孔网状结构凝胶作层析介质。凝胶具有海绵状立体网孔结构，孔径较一致，犹如分子筛，故本法又有分子筛层析法之称。当不同 大小分子的混合物加至柱表面时，大分子物质不能进入胶粒的网孔内，在胶粒之 间的空隙中向下移动，首先被洗脱，而小分子物质则进入胶粒的网孔内而反复受 阻，向下移动速度慢而后被洗脱，因而使混合物中分子大小不同物质顺序流出柱 外，达到分离不同大小分子混合物的目的。 二、器材与试剂 器材 磁力搅拌器、铁立架、蝴蝶夹、层析柱、离心机、紫外分光光度计 试管、烧杯、滴管、吸管、透析袋、烧瓶、洗耳球 座标纸、记号笔、橡皮筋、pH 试纸 试剂 正常血清 葡聚糖凝胶（Sephadex G-75） 饱和硫酸铵（pH7.8）、生理盐水 （4） pH8.0，0.005M 磷酸缓冲液 （5） FITC+Blue DEXTRAN 2000 混合物三、操作步骤 【盐析法】 1ml 正常血清加等量生理盐水稀释，混匀。 在稀释血清内逐滴加入 2ml 饱和硫酸铵溶液，边滴边搅拌，使其充分混匀，直至加完（此时硫酸铵饱和浓度为50%），然后置4℃冰箱 30 分钟，使蛋白质充分沉淀。 将上述样品离心（3000rpm）15 分钟，弃去上清夜。 沉淀物用少量生理盐水（约 2ml）溶解，然后逐滴加入饱和硫酸铵溶液 1ml（此时硫酸铵饱和浓度为 33%），然后置 4℃冰箱 30 分钟，使其沉淀。 将沉淀样品离心（3000rpm）15 分钟，弃去上清夜。 沉淀物用少量生理盐水（约 1.5-2ml）溶解。 将上述溶解后的样品装入透析袋并扎紧，流动自来水冲洗透析40 分钟，然后置生理盐水中透析（放冰箱）至无 NH4+存在为止（用奈氏试剂滴入透析液中， 无黄色沉淀出现即可），此样品即