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ELISA 操作流程 （一）、基本操作流程 方法一 双抗体夹心法（用于检测未知抗原的） 包被：用包被液将抗体稀释至蛋白质含量为0.5～20μg／ml，按100ul/孔加入酶标板，4℃包被过夜。 洗板：次日弃去孔内液体，在纸巾上轻轻扣打以吸去残留液体，加入洗涤液（约 280-300ul/孔），漂洗 2-3 次，每次 3-5min； 封闭：按200-250ul/孔加入封闭液，室温2-3 小时或 37℃1-2 小时，也可4℃封闭过夜，然后弃去孔内封闭液； 样品处理：用洗涤液或样品稀释液将待检样品(含未知抗原)稀释至所需浓度； 标准液：用洗涤液或样品稀释液将标准液稀释至所需浓度（定性分析可省略本步骤）； 加样：按排列顺序依次加入 50-100ul/孔稀释好的标准液、处理过的待检样品、阴性对照及阳性对照，室温或 37℃孵育 30-60min； 洗板：同步骤 2； 加酶标抗体：酶标抗体的稀释按产品说明书，按 50-100ul/孔加入新鲜配制的酶标抗体，室温或 37℃孵育 1 小时； 洗板：同步骤 2； 加底物液显色：按 100-150ul/孔加入新配制的 TMB 底物溶液，室温避光反应 15～ 30 分钟。 终止反应：于各反应孔中加入50ul 的终止液。 结果判定：可于白色背景上，直接用裸眼观察结果，反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。也可在酶标仪上于 450nm(若以 ABTS 显色，则 410nm)处测 OD 值。检测时以空白对照孔调零后测各孔OD 值，若样品孔中的 OD 值大于阴性对照孔的 2.1 倍，即为阳性。 方法二 间接法（用于检测未知抗体） 包被：用包被缓冲液将已知抗原稀释至 0.5～20μg／ml，按 100ul/孔加入酶标板， 4℃包被过夜，次日洗涤 2-3 次； 洗板：次日弃去孔内液体，在纸巾上轻轻扣打以吸去残留液体，加入洗涤液（约 280-300ul/孔），漂洗 2-3 次，每次 3-5min； 封闭：按200-250ul/孔加入封闭液，室温2-3 小时或 37℃1-2 小时，也可4℃封闭过夜，然后弃去孔内封闭液； 样品处理：用洗涤液或样品稀释液将待检样品稀释致所需浓度； 标准液：用洗涤液或样品稀释液将标准液稀释至所需浓度（定性分析可省略本步骤）； 加样：按排列顺序依次加入 50-100ul/孔稀释好的标准液、处理过的待检样品(含未知抗体),阴性对照及阳性对照，室温或 37℃孵育 30-60min； 洗板：同步骤 2； 加酶标抗体：按 50-100ul/孔加入新配制的酶标抗体（抗抗体），室温或 37℃孵育 1 小时；酶标抗体的稀释按产品说明书； 洗板：同步骤 2； 加底物液显色：按 100-150ul/孔加入新配制的 TMB 底物溶液，室温避光反应 15～ 30 分钟。 终止反应：于各反应孔中加入50ul 的终止液。 结果判定：裸眼观察结果或用酶标仪测OD 值，有色产物的生成量＝抗体量。 (二) 、ELISA 常用的四种方法 直接法测定抗原 将抗原吸附在载体表面； 加酶标抗体，形成抗原—抗体复合物； 加入底物； 结果判定：有色产物的生成量＝抗原量。 间接法测定抗体 将抗原吸附于固相载体表面； 加待检抗体, 形成抗原-抗体复合物； 加酶标抗体（抗抗体）； 加入底物； 结果判定：有色产物的生成量＝抗体量。 双抗体夹心法测定抗原 将抗原免疫第一种动物获得的抗体吸附于固相表面; 加抗原，形成抗原-抗体复合物; 加抗原免疫第二种动物获得的抗体，形成抗体抗原抗体复合物; 加酶标抗抗体(第二种动物抗体的抗体); 加入底物； 结果判定：有色产物的生成量＝抗原量。 竞争法测定抗原 将抗体吸附在固相载体表面; 加入酶标抗原和待测抗原； 加入底物； 结果判定：对照孔与样品孔有色产物的生成量的差与未知抗原的量成负相关。