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无菌实验预防假阳性措施 1在一个专门准备、环境控制的房间内的层流罩的环境中进行测试 2在整个测试过程中使用无菌技术 3用避免污染的方法把测试器皿、培养基和测试物品引入测试区 4测试产品表面的细菌污染，在引导测试物品进入测试区之前，先对产品的外包装进行消毒。 5对测试中使用的设备、材料和产品进行灭菌 6简化进行测试必须的操作 7尽量避免悬浮微粒的产生 8环境时时监测（沉降菌检测） 第六十一页，共一百零一页。 无菌实验相关标准 GBT19973.2-2005-医用器材的灭菌 微生物学方法 第二部分：确认灭菌过程的无菌试验 ISO 11737-2 2009-医用器材的灭菌 微生物学方法 第二部分：确认灭菌过程的无菌试验 第六十二页，共一百零一页。 无菌实验：培养条件 不论哪种无菌试验方法：FTM32.5±2.5℃，不少于14天；SCDB22.5±2.5℃，不少于14天； 改良马丁23-28℃，不少于14天。 如果14以内观察到阳性结果，不必继续培养。 第六十三页，共一百零一页。 无菌实验阳性对照 应根据供试品特性选择阳性对照菌：无抑菌作用及抗革兰阳性菌为主的供试品．以金黄色葡萄球菌为对照菌；抗革兰阴性菌为主的供试品以大肠埃希菌为对照菌；抗厌氧菌的供试品，以生孢梭菌为对照菌；抗霉菌的供试品，以白色念珠菌为对照菌。加菌量小于l00cfu，供试品用量同供试品无菌实验时每份培养基接种的样品量。阳性对照管培养48～72小时应生长良好． 第六十四页，共一百零一页。 阴性对照 阴性对照：阴性对照供试品无菌实验时，应取相应溶剂和稀释同法操作作为阴性对照。阴性对照不得有菌生长。 第六十五页，共一百零一页。 无菌实验：结果判断 肉汤培养基有菌生长的常见三种形式： 混浊生长：液体变混浊。 菌膜：液体澄清，表面有一薄层菌膜。 沉淀生长：液体澄清，管底有沉淀物 第六十六页，共一百零一页。 混浊生长：液体变混浊 第六十七页，共一百零一页。 肉汤培养基有菌生长的常见形式 第六十八页，共一百零一页。 无菌实验：结果判断 1.阳性对照管应生长良好，阴性对照管应无菌生长 2.培养期间逐日观察并记录是否有菌生长，如培养14天后，培养基出现浑浊，但不能确定是否有微生物生长，可取该培养液适量转种至同种新鲜培养基或划线接种于斜面培养基上，细菌培养两天，霉菌培养三天，观察接种的同种新鲜培养基是否再出现浑浊或斜面是否有菌生长；或取培养液涂片，染色，镜检，判断是否有菌。 第六十九页，共一百零一页。 释出物检查 第七十页，共一百零一页。 无菌实验验证：释出物检查 目的：对未知或可疑的供试品，在进行无菌试验实验前进行方法验证试验，以确认供试品在该试验条件下无抑菌活性或其抑菌活性可以忽略不计。 第七十一页，共一百零一页。 微生物基本操作 琼脂平板接种法 琼脂斜面接种法 半固体接种法 肉汤培养基接种法 第二十九页，共一百零一页。 琼脂平板接种法 细菌在自然界及人体中分布广，种类多，为了了解菌谱，须先将各种细菌分离，获得纯菌培养物后才能进一步作细菌的鉴定。琼脂平板培养基因面积大，接种后可达到分离的目的，常称分离培养法。平板接种方法有多种。以下介绍平行划线法及分区划线法。 第三十页，共一百零一页。 琼脂平板接种法（分离培养法） 分区划线法 第三十一页，共一百零一页。 琼脂平板接种法（分离培养法） 平行划线法 第三十二页，共一百零一页。 琼脂平板接种法（分离培养法） 第三十三页，共一百零一页。 单个菌落 第三十四页，共一百零一页。 单个菌落 第三十五页，共一百零一页。 琼脂斜面接种法 目的：多用于纯种细菌的增菌和保存菌种 方法：用灭菌接种环取细菌培养物少许。拔去琼脂斜面培养基塞，管口经火焰上灭菌，将沾有细菌的接种环伸入管内，自下而上在琼脂上蜿蜒划线；接种后，管口在火焰上灭菌，塞回塞，接种环灭菌：在试管口处做好标记，置37℃培养18－24小时 第三十六页，共一百零一页。 大肠杆菌斜面 金黄色葡萄球菌斜面 第三十七页，共一百零一页。 肉汤接种法 目的：用于增菌。 方法：用灭菌接种环取细菌培养物少许；以无菌操作将沾有细菌的接种环伸入肉汤中，将环上细菌轻轻研磨于接近液面的管壁上，然后将试管稍倾斜，使肉汤碰及细菌即可；接种后管口灭菌，塞回塞，接种环灭菌，并做好标记，置37℃培养18-24小时 第三十八页，共一百零一页。 半固体接种法（穿刺接种法） 目的：增菌和保存菌种；观察细菌有无动力。 方法：用接种针，将取有细菌的接种针自培养基中央刺入（不要接触管底），沿原穿刺线拨出，注意在刺入与拔出时不可晃动接种针；接种后做好标记。置37℃培养18-24小时． 第三十九页，共一百零一页。