细胞分子生物学课件.pptxVIP

基因工程载体第一节表达载体一、基本概念定义：指能有效运载外源DNA片段进入受体细胞内进行复制、扩增、传代乃至表达的自主复制的DNA分子常用的载体：① 质粒（plasmid）载体② 噬菌体(phage) 载体③ 病毒载体④ 其他载体 一般特点: ①能在宿主细胞中独立自主地复制 ② 容易从宿主细胞中分离纯化 ③ 有1非必需区域，插入外源基因后仍可进行复制和扩增 ④ 具有灵活的克隆位点和方便的筛选标记 ⑤ 具有控制外源基因表达的启动子、阻遏子和终止子二、原核细胞表达载体 基本结构：除克隆载体的基本结构元件外，还有控制外源基因表达的启动子和终止子表达方式：非融合表达：载体仅含控制外源基因表达的启动子和终止子，目的基因需有自己的翻译起始码，表达产物无额外结构融合表达：除启动子和终止子外，载体还含融合标签（fusion tag)，目的基因不含自身翻译起始码，而且必须与标签融合成同一阅读框。优点是便于表达产物提纯，缺点是可融合标签可能影响表达产物生物活性和抗原性胞内表达：表达产物存在于宿主细胞内，需破碎细胞才能获得融合表达载体结构示意图4.分泌表达：除其他结构元件外，载体还有引领表达产物向细胞外分泌的信号肽序列，目的基因须与信号肽正确融合，表达产物位于细胞周质或培养液中，生物活性较强，便于分离纯化分泌型表达载体pEZZ18载体S：葡萄球菌A蛋白信号肽序列；Z：A蛋白IgG结合结构域。目的蛋白以与“ZZ”肽融合方式表达，在信号肽引导下分泌到细菌培养液，便于用IgG Sepharose? 亲和柱纯化原核细胞表达系统的优缺点：优点：最早采用、最为成熟的表达系统，技术相对简单，能在较短时间内获得表达产物，所需成本较低缺点：难以进行表达时间及水平的调控；有些外源基因的持续或过量表达可能对宿主菌产生毒害作用；缺乏真核细胞的翻译后加工修饰机制，表达产物多为不溶性包涵体，生物活性较低，纯化较难 三、真核细胞表达载体分类：酵母表达系统 昆虫细胞表达系统哺乳动物细胞表达系统2.优缺点：优点：目的基因可含自身调控序列，表达便于时空调节；具有翻译后加工修饰机制，表达产物具有天然的结构，生物活性强 缺点：技术相对复杂；表达水平较低（特别是哺乳动物细胞表达系统，成本较高）（一）酵母表达载体基本结构特点：多为整合型质粒，含酵母染色体同源序列，可整合入酵母染色体中以酵母菌可诱导表达基因的强启动子控制外源基因的表达多为大肠杆菌/酵母菌穿梭载体2. 宿主菌：目前以毕赤酵母（Pichia Pastoris）应用最多3. 转化方法：原生质体转化法，电击法，氯化锂法4.优点：兼有原核细胞和真核细胞表达系统的优点，包括基因操作相对简单，表达水平较高（可达克级/L培养液），成本较低，翻译后加工接近哺乳动物细胞酵母表达载体的结构示意图（二）昆虫细胞表达载体基本结构：杆状病毒是常用的昆虫细胞表达载体，其中最常用的是苜蓿银纹夜蛾杆状病毒(AcNPV) ，传递质粒含核多角体基因强启动子基本原理：将含外源基因的传递质粒与野生型 AcNPV共转染昆虫细胞，通过同源重组获得重组病毒，再用重组病毒感染昆虫细胞进行外源基因表达优缺点：表达水平很高，昆虫细胞具有哺乳动物细胞的翻译后加工修饰能力，但不能表达带有完整N-交联的糖蛋白昆虫细胞表达系统的基本原理及流程（三）哺乳动物细胞表达载体结构特点：克隆载体的基本元件：包括能在大肠杆菌中复制的复制原点、抗生素抗性基因和便于目的基因插入的限制性酶切位点启动子和增强子：多用病毒的启动子,如CMV启动子剪接信号终止信号和poIyA加尾信号真核细胞选择标记基因，如新霉素(neo)抗性基因载体类型：质粒载体：借助理化方法将含外源基因的重组质粒导入动物细胞（称为转染）；在细胞内以染色体外可自我复制的附加体形式存在动物细胞质粒表达载体结构示意图2.病毒载体：多根据同源重组原理构建成含外源基因的重组病毒，以感染方式将外源基因导入细胞内，常用的病毒载体有腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒、痘病毒等哺乳动物细胞表达系统的优缺点：表达的重组蛋白能进行正确折叠和糖基化等翻译后加工，在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于天然蛋白；但其整体表达水平偏低，成本较高 腺病毒表达载体结构示意图L(R)-ITR：左（右）侧末端反向重复序列；ES：包装信号；PCMV：CMV启动子；MCS：多克隆位点；right (left) arm homology:左（右）臂同源序列第二节噬菌体载体一、λ噬菌体载体基因组结构：48.5kb，两端为粘性COS末端，与在细胞内线性DNA的环化有关；基因组中央部分对溶细胞感染非必需，可被无关DNA序列取代感染周期：溶菌性感染：感染导致宿主菌死亡和裂解，在涂布细菌的培养基上形成噬菌体空斑（plaque)溶原性感染：温和噬菌体感染细菌后，以位点特异方式将其基因组整合进