蛋白质的测定.pdfVIP

蛋白质的测定 一、概述 蛋白质的分析方法很多。可分为两类 ∶一是利用蛋白质的共性，即含氮量、肽键和折射 率测定蛋白质含量；另一类是利用蛋白质中特定氨基酸残基、酸、碱性基团和芳香基团测定 蛋白质含量3。最常用的方法是开氏法，因其中尚有氨基酸、酰氨等非蛋白质氮，故称 “粗 蛋白质”，如果蛋白质用重金属盐等沉淀分离以后，进行全氮测定，由氮换算而成的蛋白质 的含量，则称为 “纯蛋白质”。 开氏法是测定全氮量的经典方法。这个方法是丹麦人开道尔 （J.Kjeldahl）于1883 年用 来研究蛋白质变化的，后来被用于测定各种形态的有机氮。由于设备简单易得，结果可靠， 为一般实验室所采用。至今尚无别的方法能与其比拟或将其取代。因此国际谷物化学协会 质 （ICC）【7】和美国分析化学家协会 （AOAC）【8】以及我国等一些国家都把开氏法作为标准 的分析方法。但开氏法也有缺点，主要是操作手续较繁，分析的速度较慢，试剂费用较高。 近年已出现几种以开氏法原理为基础的全自动或半自动的开氏定氮仪，如瑞典的Tecator 公 液 司生产的开氏1030 分析仪 （Kjeltec Auto 1030 Analyzer）、日本生产的kjel-Auto 自动氮和蛋 白质分析仪和丹麦FOSS 公司生产的Kjel-FOSS 自动蛋白质分析仪等。这些仪器虽然自动化程 海 度较高，但较昂贵，目前尚不能普及。 在生产和科研工作中，为了完成大批样品的分析，需要采用快速、简易的分析方法，例 如染料结合法、双缩豚法、水合茚三酮法、荧光法、红外光谱法以及测定开氏消煮液中铵的 上 靛酚蓝法和纳氏比色法。根据一般实验室的条件，在此侧重介绍开氏法、双缩脲法和染料结 合法。 质 二、粒中粗蛋白质的测定——H2SO4-K2SO4-CuSO4-Se 消煮法 方法原理 液 氮素是蛋白质中的主要成分，同类植物籽粒中蛋白质的含氮量基本上是固定不变的。因 此，可用开氏法消煮定氮，再将测得的含氮值乘以蛋白质换算系数，即得粗蛋白质含量。氮 海 含量换算成蛋白质的系数，一般采用6.25，这是由蛋白质平均含氮16%为根据导出的值，但 不同植物籽粒中蛋白质的含氮量有差异，故由氮换算为蛋白质的系数也稍有不同。详见表 上 14-2。以定量蛋白质为目的的总氮量测定中，开氏法分解时，硝态氮的部分氨化是不可避免 的，因此蔬菜类特别是可能含有硝态氮的化合物的样品，需要用水杨酸固定硝态氮化合物， 质 用开氏分解测定总氮量，同时用离子电极法测定硝态氮的含量，再从总氮量减去硝态氮量后 乘以蛋白质换算系数即得蛋白质含量。 液 仪器设备： 消煮炉或电炉、消煮管 （或开氏瓶）100mL 或50mL、半微量定氮装置、半微量 滴定管。 海 试剂 （1）20g ·L-H3BO3——指示剂溶液。称取H3BO3 （分析纯）20g 溶于1L 水中。每升H3BO3， 上 溶液加甲基红-溴甲酚绿混合指示剂20mL，并用稀酸或稀碱调节至紫红色 （pH=4.5）。 （2）0.0100mol ·L-1 （1/2H2SO4）或0.0200mol ·L-HCl 标准溶液 操作步骤 （1）样品的消煮 （*）。称取烘干样品 （过0.25mm 筛子）0.3000～0.5000g （*2）置于50mL 或100mL 开氏瓶或消煮管中