病毒检测技术及应用.pptxVIP

病毒检测技术及应用会计学第1页/共23页0205040103前言目 录病毒的分离与培养CONTENTS免疫学方法病毒核酸分子检测新型核酸扩增检测技术第2页/共23页01PART 前言第3页/共23页病毒检验技术 病毒学检验技术是用实验室检验方法对临床和流行病学现场送检的标本（如人或宿主的血液、组织、尿、粪便和组织液等）进行病毒学的定性和定量分析，为病毒感染和病毒性疾病的诊断、治疗和预防提供科学依据。 病毒检测技术反映病毒的核酸水平、感染的状态、传染性和评定治疗效果，对病情的诊断、治疗和用药上起着关键性的作用，可根据检查结果判断和选择患者适宜的抗病毒药物种类，并制定适宜的最佳治疗方案；可根据病毒核酸量的动态变化对患者用药的剂量、时间及是否需要联合用药等提供重要的参考依据。病毒检测技术在评价和观察抗病毒药物治疗的疗效、免疫增强药物的疗效及判定预后效果都有重要应用。第4页/共23页病毒检验技术流程第5页/共23页02PART 病毒的分离与培养主要有细胞培养法、鸡胚培养法、动物接种法等,而对细胞、鸡胚不敏感,又没有合适动物模型的病毒,可采用基因克隆的方法。第6页/共23页细胞培养法 二倍体细胞株来源于正常人胎儿组织，主要用于培养病毒制备疫苗等；原代细胞是指从机体取出后立即培养的细胞，原代细胞的培养是指直接从机体取下细胞、组织和器官后立即进行培养；传代细胞来源于肿瘤细胞或细胞株传代过程中变异的细胞。细胞培养瓶鸡成纤维细胞第7页/共23页鸡胚培养 鸡胚培养法是用来培养某些对鸡胚敏感的动物病毒的一种培养方法，此方法可用以进行多种病毒的分离、培养，毒力的滴定，中和试验以及抗原和疫苗的制备等。 不同病毒在鸡胚的不同部位的生长特性差异很大，选择不同的接种部位是病毒分离成功的关键：尿囊腔接种、羊膜腔接种、卵黄囊接种、绒毛尿囊膜接种一般选用9～14d的鸡胚优点:来源充足、组织分化程度低、本身很少携带病毒和细菌、对接种病毒不产生抗体及病毒较易增殖等尿囊腔接种：常用于流感病毒、流行性腮腺炎病毒和新城疫病毒的适应和传代培养第8页/共23页动物接种常用的实验动物有小白鼠、乳鼠、豚鼠、家兔、猴和鸡等；常用的接种途径包括皮下、皮内、腹腔、静脉、角膜、鼻腔及脑内接种等方式；第9页/共23页病毒增殖的观察病毒在细胞内增殖的鉴定指标 1．细胞形态的改变 2．红细胞吸附 3．细胞培养液pH值改变病毒数量及病毒感染性测定 1．血凝试验 2．中和试验 3．空斑形成试验 4．半数感染量（ID50）和组织培养半数感染量（TCID50）细胞形态改变红细胞吸附包涵体第10页/共23页形态学检查及诊断光学显微镜扫描电子显微镜透射电子显微镜 直接观察到较大的病毒体（如痘病毒） 、包涵体 狂犬病毒感染——嗜酸性包涵体。 用于观察病毒的大小、形态与结构及细胞内的超微结构等。 用于观察病毒和细菌表面结构和附属结构等 。第11页/共23页空斑形成试验是一种检查和准确测定病毒滴度的方法。将稀释的病毒悬液加入单层细胞培养瓶中。病毒吸附后，再覆盖一层融化的半固体营养琼脂，使病毒在单层细胞培养中有限扩散。结果是每一个有感染性的病毒在单层细胞中可产生一个局限性的感染灶。用活性染料 (如中性红) 染色，则活细胞着色，受病毒感染而破坏的细胞不着色，形成肉眼可见的空斑/蚀斑(plaque)。每个蚀斑是由一个感染性病毒颗粒形成的，称作空斑形成单位 (plaque forming unit, PFU)。病毒悬液中的感染性病毒量的滴度可用PFU／ml表示。第12页/共23页03PART 免疫学方法第13页/共23页ELISA 酶联免疫吸附测定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）采用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接，然后通过酶与底物产生颜色反应，用于定量测定。在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅定性或定量分析。由于酶的催化频率很高，故可极大地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。第14页/共23页04PART 病毒核酸分子检测第15页/共23页基因芯片 基因芯片(gene chip)又称基因微矩阵(DNA microarry)具有微型化、高通量 、并行处理易于自动化等优越性,它将大量的靶基因片段有序、高密度地排列在玻片、硅等载体上, 用荧光检测后 , 通过计算机软件进行数据比较和分析 ,一次试验就可对上万种基因进行快速、准确 、高效的检测。第16页/共23页实时荧光