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会计学1ELISA双抗夹心法检测抗原 ELISA-测抗原（Ag）或抗体（Ab）三要素抗原或抗体的固相化：已知的Ag/Ab结合到固相载体表面，并保持其免疫活性；抗原或抗体的酶标记：酶标Ag/Ab,并保持其免疫活性和酶活性；底物显色：底物被酶催化成为有色产物—定性和定量– 放大免疫反应的信号基本原理第1页/共42页 高度特异性：保持抗原抗体反应的特异性高灵敏度：酶催化底物显色的高效性， pg水平微量检测定性定量检测：反应液颜色深浅或光密度值基本特点第2页/共42页 基本类型 抗体测定法 间接法检测特异性抗体 抗原测定法 直接竞争法检测可溶性抗原 双抗体夹心法检测可溶性抗原 （改良双抗体夹心法检测可溶性抗原） 应用生物素-亲和素双抗体夹心ELISA法第3页/共42页 基本类型 抗体测定法 间接法检测特异性抗体 抗原测定法 直接竞争法检测可溶性抗原 双抗体夹心法检测可溶性抗原 （改良双抗体夹心法检测可溶性抗原） 应用生物素-亲和素双抗体夹心ELISA法第4页/共42页 显色间接法检测特异性抗体包被已知抗原与待测抗体孵育与酶标抗体孵育加入底物包被已知抗原第5页/共42页 优点:只要变换包被抗原就可利用同一酶标抗抗体建立检测相应抗体的方法操作简单迅捷缺点： 可重复性差 通常用于抗体效价的检测和某些疾病的早期诊断第6页/共42页 基本类型 抗体测定法 间接法检测特异性抗体 抗原测定法 直接竞争法检测可溶性抗原 双抗体夹心法检测可溶性抗原 （改良双抗体夹心法检测可溶性抗原） 应用生物素-亲和素双抗体夹心ELISA法第7页/共42页 直接竞争法检测可溶性抗原原理：待检抗原和一定量的酶标抗原竞争与固相抗体结合；待检抗原含量愈多，结合在固相上的酶标抗原愈少，最后的显色也愈浅。第8页/共42页 优点：待检抗原只需要一个抗原决定簇，适合小分子抗原，如，激素，药物等；操作步骤简单快捷，只需要一个保温洗涤过程缺点：酶标记抗体用量大；定量检测的灵敏度和重复性存在不足。第9页/共42页 基本类型 抗体测定法 间接法检测特异性抗体 抗原测定法 直接竞争法检测可溶性抗原 双抗体夹心法检测可溶性抗原 （改良双抗体夹心法检测可溶性抗原） 应用生物素-亲和素双抗体夹心ELISA法第10页/共42页 改良双抗夹心法双抗体夹心法检测可溶性抗原双抗夹心法第11页/共42页 优点：待测抗原需要≥2个抗原决定簇，所以适合大分子抗原的检测，一般在分子量5000D以上；由于增加了一层抗体，提高了特异性检测的灵敏度，尤其是改良双抗夹心法；只要获得针对受检抗原的特异性抗体，就可用于包被固相载体和制备酶结合物就可以建立此法；重复性较好；缺点： 操作复杂，费时费力第12页/共42页 基本类型 抗体测定法 间接法检测特异性抗体 抗原测定法 直接竞争法检测可溶性抗原 双抗体夹心法检测可溶性抗原 （改良双抗体夹心法检测可溶性抗原） 应用生物素-亲和素双抗体夹心ELISA法第13页/共42页 应用生物素-亲和素双抗体夹心ELISA法（BA-ELISA法）间接包被放大终末反应第14页/共42页 BA-ELISA原理 BA-ELISA是在常规ELISA原理的基础上，结合生物素(B，biotin)与亲和素(A，avidin)间的高度放大作用，而建立的一种检测系统。生物素是动植物体内广泛分布的一种小分子生长因子，又名辅酶R或维生素H；亲和素是卵白蛋白中提取的一种碱性糖蛋白，对生物素有非常高的亲和力；（链酶亲和素是从链霉菌中提取，对载体吸附性比前者低）亲和素与生物素都可与蛋白质(包括抗原、抗体、酶等)、荧光素等分子结合而不影响后者的生物活性，是理想的标记剂；结合了酶的亲和素分子与结合有特异性抗体的生物素分子产生反应，既起到了多级放大作用，又由于酶在遇到相应底物时的催化作用而呈色，达到检测未知抗原(或抗体)分子的目的。第15页/共42页 实验材料小鼠INF-γ检测试剂盒的组成：Capture Ab：purified anti-mouse IFN-γDetection Ab ：biotin-conjugate-anti-mouse IFN-γAvidin-conjugate-HRP Standard：recombinant mouse IFN-γ （定量测定）Coating buffer5×Assay diluent TMB solution待测样品---- 经ConA活化的小鼠淋巴细胞培养上清第16页/共42页 ELISA 操作要点样品的保存试剂的准备固相载体包被加样孵育(温育）洗涤显色和比色第17页/共42页 样本的制