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医学院大学化学实验
实验一、用紫外分光光度法同时测定维生素B2和维生素C
实验二、BSA蛋白等电点的测定
实验三、纳米金的制备与表征实验四、纳米金对BSA蛋白等电点的影响
实验一、用紫外分光光度法同时测定维生素B2和维生素C
1.实验目的
掌握在紫外区中同时测定—个双组分体系维生素B2和维生索C的实验方法。
2.仪器和试剂
916型紫外-可见分光光度计;
石英比色皿2只,
容量瓶、50ml离心管、称量纸若干。
维生素B2 (AR):VC: 冰醋酸,氢氧化钠(1M),未知溶液。
3.实验原理
维生素B2在224、267、375、444nm处具有吸收峰,一般取444nm的波峰为定量吸收峰。维生素B2又叫核黄素,化学名:7,8-二甲基-10[(2S,3S,4R) - 2,3,4,5-四羟基戊基]苯并蝶啶-2,4(3H,10H)-二酮, 分子式:C17H20N4O6 , 分子量:376.36 。分子结构如下图
VB2的分子结构 VC的分子结构
维生素C在220nm-320nm范围内有吸收峰,一般取243nm的波峰为定量吸收峰。维生素C又称抗坏血酸,分子量为176.1,其分子结构中具有二烯醇结构,其结构如图所示。抗坏血酸参与体内一系列代谢和反应,能促进胶原蛋白和粘多糖的合成,增加微血管的致密性,降低其通透性及脆性,增加机体抵抗力.缺乏时,引起造血机能障碍、贫血、微血管壁通透性增加,脆性增强和血管容易破裂出血,严重时肌肉、内脏出血死亡。人体不能自身制造VC,必须不断地从食物中摄入Vc,通常还需储藏能维持一个月左右的Vc。
在同一溶液中同时测定双组分的具体方法:在a和b的最大吸收波长λ1及λ2处,分别测定混合物的吸光度Aλ1、Aλ2,如下图:
两组分吸收光谱图
(I:吸收光谱不重叠;II:二组分吸收光谱重叠)
然后解联立方程组,求得出各组分的含量。
在λ1处:
在λ2处:
式中:Aλ1、Aλ2分别为混合液a+b在λ1、λ2处吸光度;
Aλ1a、Aλ2a分别是
Aλ1b、Aλ2b分别是混合溶液中组分b在λ1、λ2处吸光度。
首先要从已知浓度的各单独组分吸收光谱中获得:
联立求解式(1)和(2)组成的方程组可求得Ca、Cb。采用此法可求得两种以上组分的含量。
4.操作步骤
1. VB2标准溶液的配置:准确称取75mg核黄素(维生素B2),置于1000 mL容量瓶中,加少量水使维生素B2溶解,最后加水定容至刻度得到维生素B2标准试剂(0.075 mg/mL)。
2. VB2系列标准溶液的配制:用移液管分别吸取0ml、2mL、4mL、5mL、6mL、8mL维生素B2标准试剂于6个50 mL离心管中,加水定容至25ml,摇匀。
3、确定VB2最大吸收波长,从上述4ml试管中取2ml加入到比色皿中,用紫外分光光度计进行220-500nm的光谱扫描,找出其吸光度最大时的吸收波长(?max=444nm)。
3、绘制VB2标准曲线:用移液枪分别吸取0ml、2mL、4mL、5mL、6mL、8mL离心管中的溶液2ml加入到比色皿中,在?max444nm 和?max243nm处分别测6支试管的吸光度,以VB2溶液浓度为横坐标,以蒸馏水为参比,A444nm和A243nm吸光度数值为纵坐标,建立VB2浓度与吸光度的标准曲线
4、VC标准溶液的配置:称取0.0132gVc标准品于100ml的烧杯中,用超声波助溶器帮助溶解并定容于500ml容量瓶中,摇匀,配成贮备液。
5、配制VC系列标准溶液:从上述贮备液中分别吸取0ml、0.5ml、1ml、2ml、4ml、8mlVc加入50ml离心管中,用蒸馏水定容至25ml。
6、确定VC最大吸收波长
从上述4ml试管中取2ml加入到比色皿中,用紫外分光光度计进行220-500nm的光谱扫描,找出其吸光度最大时的吸收波长(?max=243nm)。
7.绘制VC标准曲线: 用移液枪分别吸取分别吸取0ml、0.5ml、1ml、2ml、4ml、8mlVC 6支离心管中的溶液2ml加入到比色皿中,在?max444nm 和?max243nm处分别测6支试管的吸光度,以VC溶液浓度为横坐标,以蒸馏水为参比,A444nm和A243nm吸光度数值为纵坐标,建立VC浓度与吸光度的标准曲线。
8.待测样品溶液制备
(1)VB2待测液的配置:取待测VB2片剂1片研细,称重后取5mg置于100mL烧杯中,加冰醋酸3mL与水10mL,置水浴(100 ℃)加热1小时,使维生素B2溶解,冷却后转移至50ml离心管中,加氢氧化钠液(1 mol/L)3 mL,用水稀释至刻度25ml作为待测液。
(2)Vc待测液的配置:取待测Vc片剂1
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