用磁珠法来提取核酸中使用的裂解液的作用原理分析.pdfVIP

磁珠法核酸提取裂解液的作用原理 文章来源：洛阳吉恩特生物科技有限公司 磁珠法核酸提取是以纳米生物磁珠为载体的一种新型核酸提取技术，核酸分子可与磁珠表面的硅羟基发 生特异性识别与结合，在外部磁场的作用下发生聚集或分散，彻底摆脱传统核酸提取过程中离心、抽取 上清液等手工操作流程，从而实现核酸的自动化提取。广泛应用于临床疾病诊断、输血安全、法医学鉴 定、环境微生物检测、食品安全检测、分子生物学研究等多种领域。 磁珠法核酸提取一般包括裂解、结合、洗涤、洗脱四个主要步骤，每一步骤又可由多种不同的方法单独 或联合实现，其中裂解环节是决定提取之质量的重中之重，经常也会有老师问到应该如何对裂解液进行 优化。那么，我们就来分析一下配置裂解液经常用的试剂及其作用原理。 1、盐酸胍、尿素 盐酸胍在浓度为4-8mol时可断裂氢键，有两种可能机制：1、变性蛋白和盐酸胍、尿素优先结合，形成变 性蛋白-变性剂复合物，当复合物被除去，引起N-D 反应平衡向右移动，随着变性剂浓度增加，天然状态 的蛋白不断转变为复合物，最终导致蛋白质完全变性；2、盐酸胍、尿素对氨基酸具有增溶作用，能形 成氢键，当浓度高时，能破坏水的氢键结构，成为非极性残基的较好溶剂，使蛋白质内部的疏水残基伸 展和溶解性加强，盐酸胍、尿素引起的蛋白变性往往是不可逆的。 同时盐酸胍是一个核酸酶的强抑制剂，但并不是一种足够强的变性剂，可以允许完整的RNA从富含 RNase的组织中提取出来。高浓度尿素同样可以使蛋白质变性并抑制Rnase活性。 2、异硫氰酸胍 蛋白质变性剂，能迅速溶解蛋白质，导致细胞结构破碎，核蛋白由于其二级结构的破坏消失而迅速与核 酸分离。在通常使用的蛋白质变性剂中作用最强的是异硫氰酸胍，它们可以使多数蛋白质转换成一种随 机的卷曲状态。含有强力的阴离子和阳离子基团，它们可以形成较强的氢键。在还原剂存在的情况下， 异硫氰酸胍可以断裂氢键，而去垢剂，如SDS存在的情况下，可以破坏疏水作用。 3、二硫苏糖醇（DTT） 二硫苏糖醇的主要作用是破坏RNase蛋白质中的二硫键，使Rna酶变性，同时抑制酚类氧化引起的磷酸二 酯键的断裂及导致RNA和DNA的交联。 二硫苏糖醇刺激性气味不大，毒性较低。由于容易被空气氧化，因此DTT 的稳定性较差；但冷冻保存或 在惰性气体中处理能够延长它的使用寿命。由于质子化的硫的亲核性较低，随着pH值的降低，DTT的有 效还原性也随之降低；DTT 或含有DTT的溶液不能进行高压处理。 4、蛋白酶K 一种切割活性较广的丝氨酸蛋白酶。它切割脂族氨基酸和芳香族氨基酸的羧基端肽键。此酶经纯化去除 了RNA酶和DNA酶活性。由于蛋白酶K在尿素和SDS 中稳定，还具有降解天然蛋白质的能力，因而它应 用很广泛，包括制备脉冲电泳的染色体DNA ，蛋白质印迹以及去除DNA和RNA制备中的核酸酶。蛋白酶 K的一般工作浓度是50—100μg/ml。在较广的pH范围内（pH 4-12.5 ）均有活性。 以上是裂解液中常用的试剂，在实际操作中针对不同的样本（植物组织、动物组织、全血、血清、质 粒）应配制不同浓度的裂解缓冲液，并根据样本的状态（质量、体积）及期望达到的实验结果（核酸的 浓度、OD比值）对裂解液的浓度进行调整，此外，还要对结合、洗涤、洗脱三个步骤进行优化，从而得 到较完美的核酸提取方案。 各位老师对磁珠法核酸提取方案有任何疑问，欢迎登陆吉恩特生物 （Giant-bio）的官方网站进行讨论或找高经理零叁柒玖陆肆捌伍玖玖壹玖洽谈交流！！