荧光定量PCR实验设计及优化.pptxVIP

会计学1 2PCR的建立与优化核酸纯化与逆转录PCR试剂体系引物、探针的设计第1页/共32页 33长度 16 - 24 bases（引物） 序列 不能有以下情况：任意2个引物或探针之间的序列互补引物或探针本身有二级结构连续的 GGG，引物的5’端有G引物3’端最后5个碱基有2个以上的G或C引物3’端最后1个碱基为A GC含量 40 - 60 % GC  GC/AT分布大致均衡,C含量G探针复性温度 65－70°C 引物复性温度 60－65°C PCR引物与探针第2页/共32页 4标记 淬灭基团采用无荧光背景的如BHQ, 不要用tamraPCR产物长度 50－150bpDesign primer design software，选择序列保守区域 如果保守区域太短，可以在引物中考虑引入LNA提高Tm 探针可以考虑引入LNA或改用MGB或自淬灭taqman探针 简并引物或探针需要同时考虑多种情况下的Tm高低纯化与否 PAGE/ HPLC PCR引物与探针第3页/共32页 5SNP的Taqman双色检测中，突变探针一般Fam标记相对定量分析中内参基因一般Hex标记 (例如Roche的UPL相对定量解决方案) 对检测要求更高的建议Fam标记(灵敏度或者 定量 vs 定性) 扩增效率较差的建议Fam标记 PCR引物与探针第4页/共32页 6Reaction ConditionsPrimers and ProbesConcentration Range (final con.)Primers: 0.1 μM – 1.0 μM eachProbes: 0.1 μM – 0.5 μMStandard Concentrations (final conc.)Primers: 0.5 μM eachProbes: 0.2 μMExample: Universal ProbeLibrary assayHigher primers/probe concentrations give better signal to noise ratio (higher fluorescence signal intensitiy)Only minor influence on Cp when used in medium concentration ranges第5页/共32页 7PCR的建立与优化核酸纯化与逆转录PCR试剂体系引物、探针的设计第6页/共32页 8建立新的PCR体系: General Hints模板 - DNA或 cDNA 为模板对照 - NTC (no template control) 每个探针引物组合 - 阳性对照 (如果可能)分析 - 扩增: sensitivity and efficiency of PCR (crossing points)- 熔解曲线分析 (SYBR Green I format):检测引物二聚体或其它非特异性扩增凝胶电泳: 验证非特异性扩增 melting curve (杂交探针等模式): 突变检测或亚型分析第7页/共32页 9Standard Conditions in PCRMgCl2 Concentration: 2 - 5 mM第8页/共32页 10Basic Optimization in PCRUse any template nucleic acid (NA) suitable for PCR, sufficiently purified andfree of PCR inhibitors Template Concentration: 建议测试多个稀释度 (最少2个梯度,10^2) genomic DNA 50 ng - 5 pg plasmid DNA approx. 106 copies RNA ≤ 500 ng total RNA or 100 ng mRNA cDNA ≤ 50 ng equivalent of total RNA ，RT product undiluted, 1:10