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抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性的测定 过氧化氢酶（CAT）活性测定 过氧化物酶（POD）测定方法 超氧化物歧化酶（SOD）活性测定 小组第一次讨论结果： 一、抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性的测定 1.原理 APX 是植物体内重要的抗氧化酶, 主要功能是分解H O , 此过程通过抗坏 2 2 血酸- 谷胱甘肽循环来完成。此外, 它还直接参与抗坏血酸的氧化还原代谢, 而 抗坏血酸能有效地清除多种活性氧自由基。因此，APX被认为与果实的抗热性直 接相关。 2.所用方法 （1）采用碘液滴定法: 称取新鲜材料1 g ，剪碎置研钵中，加少量石英砂及pH值6.0 的磷酸盐缓 液，迅速研磨成浆，20 ℃下浸提30 min ，中间摇动数次，3000 r /min 离心后保 留上清液即为酶液。反应底物为抗坏血酸，加入酶液2 mL ，20 ℃下反应10 min 后，立即加入偏磷酸1 mL ，终止酶的活动，抗坏血酸被消耗的量，可用碘液滴 定剩余的抗坏血酸来进行测定，加淀粉溶液几滴作指示剂，以碘液滴定出现浅蓝 色为止，记录滴定值，用底物被消耗的量来表示APX 的活性。每个处理设3 个 重复。 （2 ）紫外吸收法： 称取1g 芥蓝叶片组织，加入1.6 mL 预冷的磷酸缓冲液（PBS-K ）（pH 7.8 ） 提取液（含1 mmol· L-1 AsA，3 mmol· L- 1β-巯基乙醇，0.5 mmol· L-1PMSF ，2% PVP ，1 mM EDTA）。用液氮研磨，提取液于4 ℃，12000×g 离心20 min ，上清 液用于酶活性的测定。取0.10 ml 酶液 （可视情况调整），加入1.70 ml 含0.1 mM EDTA-Na2 的PBS （0.05 mol/L ，pH7.0 ），再加入0.10 ml 5 mM 的AsA ，最后加 入0.10 ml 20mM H O ，立即在20℃下测定D290 （紫外）值在一定时间内的变 2 2 化，计算单位时间内AsA 减少量，并求酶活性（室温下测定，缓冲液调零）。 APX 总活性(uM·g-1·min-1) = △OD×Vr/ (A×d×Vt×W×△t) △OD ：反应时间内吸光度的变化； △t ：反应时间，min ； Vr：提取液体积，mL ； A ：消光系数，2.8mM-1 ﹒cm-1 ； d ：比色杯厚度，1cm； Vt ：测定液体积，mL ； W ：样品鲜重，g 。 二、过氧化氢酶（CAT）活性测定 1.原理 过氧化氢酶（CAT）属于血红蛋白，含有铁，能够催化过氧化氢分解为水和 氧分子，此过程中起传递电子的作用，过氧化氢既是氧化剂又是还原剂，因此可 根据H O 的消耗量或O 的生成量测定该酶活力大小。在反应系统中加入一定量 2 2 2 （反应过量）的过氧化氢溶液，经酶促反应后，用标准高锰酸钾溶液（在酸性条 件下）滴定多余的过氧化氢。即可求出消耗的H O 的量。 2 2 2.CAT活性测定方法 碘化钾滴定法： 本方法利用H O 能将KI 中的I-氧化，生成I ，以淀粉作为滴定终点指示剂， 2 2 2 用硫代硫酸钠滴定，计算出生成I 的量，再换算所消耗H O 的量。取100ml 三 2 2 2 角瓶6 个，编号，向各瓶准确加入稀释后的酶液 10ml 立即向4 、5、