基因工程中常用的工具酶.pptxVIP

基因工程中常用的工具酶会计学第1页/共42页第二章 基因工程中常用的工具酶第一节 限制性核酸内切酶与DNA分子的体外切割第二节 DNA连接酶和DNA分子的体外连接第三节 其他工具酶第2页/共42页第一节 限制性核酸内切酶与DNA分子的体切割 限制性核酸内切酶，是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶。 一、寄主控制的限制与修饰作用如图2-1，图2-2二、限制性核酸内切酶的制备方法三、限制性核酸内切酶分类和命名四、Ⅱ型限制性核酸内切酶的基本特性五、影响限制性内切酶活性的因素第3页/共42页分类： Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅰ ：识别和切割位点不固定，随机性。 Ⅲ ：核酸内切酶活性和甲基化活性是不分开的。Ⅱ：能在识别位点处切割DNA，切割位点固定。核酸内切酶活性和甲基化活性是分开的。常用。第4页/共42页四、Ⅱ型限制性核酸内切酶的基本特性识别序列 ：1.4~7个核苷酸组成的特定核苷酸序列 2.回文结构：两个顺序相同的拷贝在DNA链上呈反向排列。 EcoRⅠ 5 ’-G AATTC-3 ’ 3 ’-CTTAA G-5 ’第5页/共42页经限制酶切割后的位点,DNA断裂类型1.粘性末端(1)3’-OH单链延伸的粘性末端.如：Pst Ⅰ 5’-CTGCA G-3’5’-CTGCA G-3’ 3’-G ACGTC-5’ 3’-G ACGTC-5’ (2)5’-P单链延伸的粘性末端.如：EcoRⅠ 5’-G AATTC-3’ 5’-G AATTC-3’ 3’-CTTAA G-5’ 3’-CTTAA G-5’ 第6页/共42页2.平末端 如:SmaⅠ 5’-CCC GGG-3’ 3’-GGG CCC-5’两种特殊的限制酶(1)同尾酶 识别位点不同，酶切后产生同样的粘性末段的两种酶。如：BamH Ⅰ和Bgl Ⅱ(2)同裂酶 识别序列相同，对甲基化切点敏感性不同的两种酶 。如:Mbo Ⅰ和Sau3AⅠ共同识别序列GATC ，但对GmeATC切点,前者不能切，后者能切。第7页/共42页五、影响限制性内切酶活性的因素1.DNA的纯度2. DNA的甲基化（1）基因工程使用失去甲基化酶的大肠杆菌（2）研究基因工程DNA的甲基化程度（3）改变限制酶的识别特性3.温度4.分子结构5.限制酶的缓冲液星号活性EcoRⅠ切 GAATTC EcoRⅠ*切 pupuATpypy 或AATT第8页/共42页第二节 DNA连接酶和DNA分子的体外连接一、DNA连接酶 DNA连接酶（Ligase）是一种能够催化在双股DNA链的3′-OH和5′-P之间形成磷酸二酯键的酶，可连接互补粘性末端或平端以及缺口修复，不能连接单链DNA或裂口. 温度二、DNA分子的体外连接第9页/共42页二、DNA分子的体外连接1．粘性末端DNA片段的连接和单切点的磷酸化2．平末端DNA片段的连接（1）T4DNA连接酶法（2）同聚物加尾法（3）用化学合成的衔接物连接DNA分子第10页/共42页第三节 其他工具酶一、大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ二、DNA聚合酶Ⅰ大片段（Klenow酶）三、T4DNA聚合酶四、逆转录酶五、末端脱氧核苷酰转移酶六、核酸酶S1七、核酸酶BAL31八、外切核酸酶Ⅲ九、T4多聚核苷酸激酶十、碱性磷酸酶十一、 甲基化酶第11页/共42页命名 HindⅢH: Haemophilus 嗜血杆菌属in: influenzae流感d: Rd株Ⅲ：该菌株中第三个被分离到的限制酶第12页/共42页同尾酶BamHI和BglII ?AGATCT? ?GGATCC? ?TCTAGA? ?CCTAGG? BglⅡ BamHI ?A GATCC? ?TCTAG G? T4连接酶 AGATCC? （连接后的切点均不能被上述两种酶切） TCTAGG?一、大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ第13页/共42页1.三种活性（1）5’-3’聚合酶活性（在有dNTP时）（2）3’外切酶活性 （无dNTP时大亚基活性）（3）5’外切核酸酶活性（无dNTP时小亚基活性）2.在基因工程中的应用 ：缺口平移标记技术。第14页/共42页二、DNA聚合酶Ⅰ大片段（Klenow酶）1.DNA聚合酶活性 （切除小亚基，保留大亚基）2. 3’外切酶活性（无dNTP时）3. 在基因工程中的应用 （1）标记粘性末端.?-32P—dNTP 标记平末端?-32P—dNTP（2）将5’端伸出的末端填平 （3）可用来反转录合成双链cDNA。 （4）补平粘性末端。 三、T4DNA聚合酶第15页/共