基因工程与体外表达.pptxVIP

基因工程与体外表达会计学第1页/共65页基因工程：为实现基因克隆所采用的方法及其相关的工作。基因重组示意图*.第2页/共65页第一节 基因工程的工具酶常用的工具酶：限制性核酸内切酶切割DNADNA连接酶生成3′- 5′磷酸二酯键DNA聚合酶Ⅰ探针标记、补平3′末端反转录酶cDNA合成多聚核苷酸激酶5′磷酸化、探针标记末端转移酶3′末端多聚尾碱性磷酸酶切除末端磷酸基*.第3页/共65页一、限制性核酸内切酶一类能识别双链DNA分子中特异核苷酸序列的DNA水解酶 特异核苷酸序列 ： 大多为 4~6 bp 回文对称（palindrome sequence） 5’GAATTC 3’ 5’GGATCC 3’3’CTTAAG 5’ 3’CCTAGG 5’1.分类： 根据酶的基因、蛋白质结构、依赖的辅助因子及与DNA结合和裂解的特异性，限制性内切酶可分为三型，即Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型。*.第4页/共65页 Ⅰ型酶具有限制和修饰作用。要求DNA分子上有特定的识别顺序，并在此识别位点下游100至1000bp处切割。 Ⅲ型酶与Ⅰ型酶一样，有限制和修饰作用。但在识别位点附近切割DNA，但切点难以预测。 Ⅱ型酶并不兼有甲基化酶的活性。在DNA分子内部的识别特异位点并切割双链DNA，切割为点固定、已知，是基因克隆重常用的工具酶。*.第5页/共65页*.第6页/共65页*.GGATCCCCTAGGGTCGACCAGCTGGCCTAGGATCC GGTCCAGGACCTG第7页/共65页HindⅡBam HⅠ*.++平端粘端GCCTAGGCCTAGGGATCCCCTAGGGGATCCCCTAGGGATCC GGATCC G第8页/共65页4.同功异源酶：来源不同的限制酶，但能识别和切割同一位点，这些酶称同功异源酶。*.Bam HⅠ+BstⅠ+ AGATCT TCTAGA GGATCC CCTAGG GATCC GATCTAG GATCT AGCCTAG第9页/共65页 有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割DNA后，产生相同的粘性末端，称为同尾酶。这两个相同的粘性末端称为配伍未端(compatible end)。*.Bg lⅡBam HⅠ++第10页/共65页二、其他常用的工具修饰酶DNA聚合酶ⅠDNA聚合酶Ⅰ大片段反转录酶T4DNA连接酶碱性磷酸酶：去除5’端磷酸基团末端脱氧核苷酰转移酶(TdT)：将dNTP加到DNA的3’-OH上；或进行同聚物加尾。Taq DNA聚合酶*.第11页/共65页第二节 基因克隆的载体 为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。*.克隆载体(cloning vector)为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体称为克隆载体。表达载体(expression vector) 为使插入的外源DNA序列可转录翻译成多肽链而特意设计的载体称为表达载体。第12页/共65页一、常用的克隆载体（一）质粒 (plasmid)——存在于细菌染色体外的小型环状双链DNA分子*.特点 能在宿主细胞内独立自主复制；带有某些遗传信息, 会赋予宿主细胞一些遗传性状。 第13页/共65页质粒（plasmid） 在细胞内的复制分两种类型严密控制型(stringent control) ? 只在细胞周期的一 定阶段进行复制 ? 在细胞内只含 1个 或几个松弛控制型(relaxed control) ? 在整个细胞周期中 随时都可进行复制 ? 在细胞内一般在20 个以上,甚至多达 数千个*.第14页/共65页克隆载体的的质粒应具备下列特点分子量小，以容纳较大的外源DNA，有较高的拷贝数；具有一个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定；具有多个限制内切酶的单一酶切位点，称为多克隆位点；便于外源基因插入。*.第15页/共65页*.第16页/共65页*.第17页/共65页（二）λ噬菌体(λphage)野生型λ噬菌体为双链线性DNA分子，两端各带12个碱基的单链粘性末端。基因组分三个区域：左侧区（含有包壳的病毒颗粒所需的全部基因）、中间区（非必需区，但包含与重组有关的基因）、右侧区（包含所有主要调控组分）。系替换型载体，外源DNA：9 ～ 23kb常用：EMBL 系列（置换型，适用基因组克隆） λgt 系列（插入型，适用cDNA克隆） charon系列*.第18页/共65页*.第19页/共65页*.第20页/共65页（三） 粘性质粒(cosmid)粘性质粒(cosmid)：又称粘粒，由λDNA的cos区与质粒构成，双链环状DNA，克隆容量：40～50kb。*.第21页/共65页（四）M13噬菌体 一种大肠杆菌雄性特异丝状噬菌体，全长6.5kb。复制型M13可用作克隆载体。 最大优点：产生单链DNA 为了便于克隆外源D