病毒鉴定的方法有哪些.pdfVIP

病毒鉴定得方法有哪些？ 从培养得细胞中分离病毒,然后采用免疫荧光与分子生物学技术进行病毒核酸检测已被 成功地用于病毒得鉴定。目前最常用得病毒定量检测方法有以下三大类:用于病毒感染力检 测得技术,如病毒空斑形成试验,半数组织培养感染剂量 TCID50 测定与免疫荧光等;病毒核酸 与病毒蛋白检测技术,如实时定量多聚酶链反应(qPCR),免疫印迹,免疫沉淀,酶联免疫吸附测 定(ELISA)与血凝试验等;还有就就是那些直接对病毒颗粒进行计数得方法,如流式细胞分析或 透射电镜技术。 病毒检测方法得局限性 病毒鉴定方法 1. 培养细胞得显微学观察 材料与仪器 细胞生长培养基:含10% FBS(胎牛血清), 4-6 mM Glutamine(谷氨酰胺)得高葡萄糖DMEM,若有 需要可加入青霉素,链霉素,庆大霉素,两性霉素等 维持培养基:上述新鲜得细胞培养基,但血清FBS 浓度减少至为2% 宿主细胞:铺满单层细胞得8 孔培养腔室玻片(chamber slides) PBS 磷酸缓冲液 Bouins 固定液 吉姆萨(Giemsa)缓冲液 吉姆萨(Giemsa)染色液 丙酮,丙酮:二甲苯(2:1),丙酮:二甲苯(1:2),二甲苯 中性树胶 移液枪头 (10 到100 微升) 移液管 生物安全柜(超净台) 二氧化碳培养箱 倒置显微镜 实验方案 接种宿主细胞至Chamber Slides:选择合适得细胞接种密度( 比如8-孔Chamber Slides,接种 30,000 细胞/孔),培养基为细胞生长培养基(10%FBS-DMEM) 。轻轻地前后左右摇晃 chamber slides 使细胞分布均匀。将细胞置培养箱培养过夜,第二天,显微镜下观察细胞确认细胞就是否 分布均匀并达到80% 以上得融合度。 制备不同稀释度得病毒液:标记6 支无菌离心管,第1 管加入990 μl 细胞生长培养基,剩 下5 管加入900 μl 细胞生长培养基。按以下方法进行梯度稀释:在第1 管中加入10 μl 病毒 原液(稀释度 1:100)充分混匀,然后从第1 管吸100 μl 至第2 管中混匀,依次类推,进行 10 倍 梯度稀释。管1 至管6 得稀释度分别为 10-3 到 10-7。 感染细胞:吸去培养孔中得培养液,每孔加入0 、5 mL 维持培养液(2%FBS-DMEM),再加入 100 μl 不同稀释度(10-2 至 10-7 稀释)得病毒液至其中一孔, 留一孔不加作为空白对照。将 细胞置二氧化碳培养箱37oC 或 34oC 培养1-4 周,追踪观察致细胞病变效应(CPE)发生情况。 吉姆萨染色:一旦观察到细胞病变效应,轻轻地用PBS 将细胞洗3 次,每次5min,然后加入 Bouins 固定液固定10 min。用吉姆萨缓冲液洗3 次,然与加入Giemsa 染液染色1 h,再用吉姆 萨缓冲液清洗后依次用丙酮处理15s,2:1 得丙酮-二甲苯处理30s,1:2 得丙酮-二甲苯处理30s, 最后用二甲苯处理10 min 紧接着用中性树胶封片。显微镜下观察CPE,包涵体,细胞融合及病 毒空泡形成情况。病毒感染细胞后形成得CPE 图片范例可以在很多图谱, 网站与博客上找到, 例如ASM Microbe Library 2、免疫荧光(IF)检测方法 材料与仪器 细胞生长培养基:含10%FBS(胎牛血清), 4-6mM Glutamine(谷氨酰胺)得高葡萄糖DMEM, 若有需要可加入青霉素,链霉素,庆大霉素,两性霉素等 宿主细胞:铺满单层细胞得8 孔培养腔室玻片(chamber slides) PBS 磷酸缓冲液 一抗 FITC 标记得二抗 细胞核染料DAPI 5-4 %多聚甲醛(PFA,pH7、4),或者甲醇 移液枪头 (10 到100 微升) 离心管 生物安全柜(超净台) 二氧化碳培养箱 荧光显微镜 实验方案 接种宿主细胞至Chamber Slides:选择合适得细胞接种密度( 比如8-孔Chamber Slides,接种 30,000 细胞/孔),培养基为细胞生长培养基(10%FBS-DMEM) 。轻轻地前后左右摇晃