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基因工程的基本操作程序教学会计学第1页/共49页抗虫棉的培育的过程：基因工程的基本操作程序第2页/共49页（1）目的基因的获取（2）（3）将目的基因导入受体细胞（4）目的基因的检测与鉴定基因表达载体的构建第3页/共49页一、目的基因的获取1.目的基因：2.获取方法：主要指的是编码蛋白质的结构基因（1）从基因文库中获取目的基因；（2）利用PCR技术扩增目的基因；（3）通过DNA合成仪用化学方法直接合成非编码区非编码区编码区编码区上游 编码区下游 终止子启动子第4页/共49页补：原核细胞的基因结构非编码区非编码区编码区编码区下游 编码区上游 启动子终止子RNA聚合酶的始结合位点RNA聚合酶的末结合位点补：真核细胞的基因结构外显子 内含子 第5页/共49页外显子结构基因内含子转录、加工修饰mRNA外显子： 能够编码蛋白质的序列叫做外显子 内含子： 不能够编码蛋白质的序列叫做内含子基因组文库基因文库 部分基因文库（cDNA文库）第6页/共49页（一）从基因文库中获取目的基因（序列未知）1. 基因文库 将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入到受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。基因文库中不是直接保管相应基因，而是保存受体菌，菌中含基因。第7页/共49页基因组文库的构建模式图第8页/共49页部分基因文库的构建模式图第9页/共49页基因组文库和部分基因文库的比较文库类型cDNA文库基因组文库文库大小基因中启动子基因中内含子基因多少物种间基因交流小大无有无有某种生物的部分基因某种生物的全部基因可以部分基因可以组成第10页/共49页作用：把单个脱氧核苷酸连接成链(形成磷酸二酯键)补：DNA复制过程：解旋酶催化1)解旋模板同时进行(边解旋边复制)2)合成互补子链 以母链为模板进行碱基配对(在DNA聚合酶的催化下,利用游离的脱氧核苷酸进行)3)形成新的DNA分子母链（旧链）子链（新链）子代DNA:3第11页/共49页前提：已知目的基因的一段核苷酸序列2.利用PCR技术扩增目的基因1概念：PCR全称为_______________，是一项在生物____复制___________的核酸合成技术。 多聚酶链式反应体外特定DNA片段2原理：DNA复制原料：模板DNA；DNA引物；四种脱氧核苷酸；热稳定DNA聚合酶第12页/共49页PCR技术的操作过程a、DNA变性（90℃-95℃）：双链DNA模板在热作用下，_____断裂，形成________氢键单链DNAb、退火（复性55℃-65℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部________。 双链c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，合成与模板互补的________。 DNA链d.重复步骤：每重复一次，目的基因增加___倍一第13页/共49页PCR技术的操作过程第14页/共49页PCR技术的操作过程PCR反应体系中目的基因成指数(2n)形式扩增第15页/共49页PCR技术扩增与DNA复制的比较DNA复制PCR技术场所原理条件解旋方式酶特点结果主要在细胞核内体外复制碱基互补配对原则碱基互补配对原则四种脱氧核苷酸、模板、酶、ATP四种脱氧核苷酸、模板、酶、引物解旋酶催化解旋DNA在高温下变性解旋细胞内的DNA聚合酶、解旋酶等热稳定的DNA聚合酶半保留复制、边解旋边复制半保留复制、全解旋再复制形成整个DNA分子大量的DNA片段第16页/共49页变性、退火、延伸三步曲 过程：变性：90～95℃退火：55～60℃延伸：70～75℃第17页/共49页3. 人工合成法利用DNA合成仪人工合成的前提：基因较小，核苷酸序列已知蛋白质的氨基酸序列推测思考：化学法合成的目的基因含内含子、启动子和终止子吗？mRNA的核苷酸序列推测基因的核苷酸序列化学合成目的基因第18页/共49页归纳：获取目的基因的方法课堂小结1、从基因文库中获取基因组文库：含有一种生物的全部基因种类部分基因文库：只包含了一种生物的部分基因， 如：cDNA文库2、利用PCR技术扩增3、人工合成第19页/共49页二、构建表达载体思考：为什么要构建基因表达载体？（1）使目的基因在受体细胞中稳定存在并可以遗传给下一代；（2）使目的基因能够表达和发挥作用。第20页/共49页思考：作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？ 不可以。 因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用，还需要有其他控制元件，如启动子、终止子和标记基因等。 第21页/共49页2.基因表达载体的组成：a、目的基因b、启动子c、终止子d、标记基因它们有什么作用？第22页/共49页位于基因首端的一段特殊的DNA片段，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA。启动子：终止子：标记基因：位于基因尾端的一段特殊