实验一质粒DNA的提取及检测.pptxVIP

实验一质粒DNA的提取及检测会计学第1页/共31页　质　粒（plasmid）是染色体外小型（1-200kb）的共价、闭合、环状的双链DNA分子（cccDNA），能自主复制并能稳定遗传的遗传因子。 常常编码一些对宿主有利的酶的基因，这些基因的表型包括抗生素抗性、产生抗生素、限制酶、修饰酶等 质粒的复制：严紧型复制（1~n个）　松弛型复制（20个以上） 第2页/共31页常用的质粒载体是通过DNA重组技术构建而成的。pUC18, pUC19第3页/共31页质粒提取的思路质粒的特性：共价、闭合、环状的小分子量DNA要去除的物质：　蛋白　基因组DNA　脂类及小分子杂质　RNA 第4页/共31页第一部分　质粒DNA的提取一．目的第5页/共31页了解提取质粒的原理。学习和掌握质粒提取的方法和技术。细菌的生长和质粒的扩增菌体的收集裂解及质粒DNA的分离质粒DNA的纯化二．原理第6页/共31页碱变性法提取主要是利用共价闭合环状质粒与线性染色质在拓扑学上的差异：在碱性环境中，线性的大分子量细菌染色体DNA变性，而共价闭环质粒DNA仍为自然状态；将pH调至中性并有高浓度盐存在的条件下，染色体DNA之间交联形成不溶性网状结构，大部分DNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒DNA仍为可溶状态。通过离心可除去大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质，质粒DNA尚在上清中，再用酚氯仿抽提进一步纯化质粒DNA（可省略）。第7页/共31页☆原理示意图返回目录 返回原理第8页/共31页三、实验仪器、材料与试剂 （一）仪器：恒温摇床、台式离心机、高压灭菌锅（二）材料：含pUC18（或其他）质粒的大肠杆菌、（三）试剂： LB培养基（液体、固体） 溶液I　 溶液II　 溶液III　 TE(pH8.0)第9页/共31页溶液 I50 mmol/L 葡萄糖/1mg/mL溶菌酶25 mmol/L Tris·Cl (pH8.0)10 mmol/L EDTA (pH8.0)在10 lbf/in2(6.895×104Pa)高压下蒸汽灭菌15分钟，保存于4℃。 作用：裂解细胞，鳌合金属离子使金属酶失活第10页/共31页溶液 II0.2 mol/ L NaOH(从5mol/L贮存液中现用稀释)1% SDS作用：细胞壁肽聚糖在碱性下水解，核酸和蛋白质变性。第11页/共31页溶液 III5mol/L 乙酸钾60ml冰乙酸水所配成的溶液中钾的浓度为3mol/L，乙酸根的浓度为5mol/L。作用：酸性条件下质粒DNA复性，变性蛋白-SDS＋线性DNA沉淀，K＋可中和DNATE(pH8.0)第12页/共31页10 mmol/L Tris·Cl (pH8.0)1 mmol/L EDTA (pH8.0)RNA酶（降解RNA）作用：稳定ＤＮＡ第13页/共31页常用方法：小量碱裂解法特点：小量质粒制备、最简便、快捷应用：质粒酶切鉴定、克隆（粗提） 测序、转染（细提）质粒提取试剂盒满足不同需要的试剂盒纯化原理：离子交换柱层析等小量制备质粒kit大量制备质粒kit去除内毒素制备质粒kit可用于大部分分生实验第14页/共31页　　四、实验步骤接含pUC18(或pET21a)质粒的单菌落于3ml LB Amp+液体培养基中?370C，190rpm振荡培养过夜?取 ml菌液入ml的离心管中 6000rpm、离心2min，弃上清，收集菌体?100uL溶液I悬浮菌体（充分振荡），室温10min?加入200uL溶液II（轻轻混匀），冰上静置5min裂解菌体第15页/共31页?加入150uL溶液III（轻轻混匀），冰上静置15min质粒DNA复性?12000rpm，离心15min，取上清记录体积到一新管?上清加等体积的酚：氯仿（振荡混匀）?12000rpm，离心15min，取上清记录体积到一新管?第16页/共31页沉淀法上清加2倍体积的无水乙醇（充分混匀），冰浴 30min?12000rpm，离心15min?沉淀用75%乙醇1mL洗涤两次（轻弹混匀、离心）?12000rpm，离心10min?晾干沉淀?沉淀用20ul TE溶解第17页/共31页吸附法吸附管用BL 500ul平衡?取上清加入吸附管?5000rpm 离心5min?加PW漂洗液500ul，放置2min?10000rpm 离心5min，晾干?加30ul TE，10000rpm 离心5min（收集到干净的EP管中）第18页/共31页第二部分　琼脂糖凝胶电泳　相关知识第19页/共31页电泳：泳动速度决定于？ 琼脂糖凝胶　天然琼脂（Agar）是一种多聚糖，主要由琼脂糖（Agarose ，约占80％）及琼脂胶（Agaropectin）组成。琼脂糖是由半乳糖及其衍生物构成的中性物质，不带电荷。而琼脂胶是一种含硫酸根和羧基的强酸性多糖，由于这些基团带