实验二碱性磷酸酶的提取及其比活性测定.pptxVIP

实验二碱性磷酸酶的提取及其比活性测定会计学第1页/共35页材料选择细胞的破碎分离纯化鉴定第2页/共35页 碱性磷酸酶 (ALP , AKP) Alkaline phosphatase一、实验目的第3页/共35页1、 掌握以有机溶剂分离技术提取蛋白质及酶的原理和方法；2、掌握酶蛋白纯化过程中的活性、比活性、得率及纯化倍数的概念及计算；3、了解AKP的临床意义及纯化蛋白质的一般方法。二、实验原理第4页/共35页1、 AKP概述 ① 催化有机单磷酸酯水解，并有转移磷酸基的作用②最适pH：～③ 特点：特异性低第5页/共35页④体内位置：细胞膜表面 -肾小管的筛状缘 -肠粘膜的微绒毛 -胆小管的细胞膜缘 -肝窦状腺表面 -胎盘合体细胞滋养层细胞外表面第6页/共35页⑤正常血清： ALP主要来自肝（或胆管）和骨骼，约各占总活性的一半。⑥临床意义：血清ALP活力增高常见于 -肝胆疾病（胆道阻塞等） -骨骼疾病（佝偻病等） -甲状腺功能亢进 -妊娠和生长期儿童第7页/共35页2、AKP的分离、提取、及纯化整个制备过程可分为 5 个阶段：①材料的选择和预处理，②细胞的破碎，③提取，④纯化（包括盐析、有机溶剂提取、层析、电泳等），⑤浓缩、干燥及保存。第8页/共35页① 取材 取酶含量丰富、容易提取、新鲜的组织本次实验：肝脏② 生物组织与细胞的破碎第9页/共35页机械破碎法 ：高速组织捣碎机、匀浆器、研钵渗透破碎法 ：低渗条件使细胞溶胀而破碎 反复冻融法 ：超声波法：超声波震荡器使细胞膜上所受张力不均而使细胞破碎 酶法 ：如用溶菌酶破坏微生物细胞 ③ 选择合适分离提取方法第10页/共35页把混在酶制剂中的大量杂蛋白及其它大分子物质（核酸、脂类、多糖）去除掉把酶从溶液中提取出来第11页/共35页有机溶剂方法—— 有机溶剂分段沉淀法原理： 利用不同的蛋白质在不同浓度的有机溶剂中有不同的溶解度而进行分离。第12页/共35页有机溶剂：① 正丁醇 能去除与pro结合的脂类物质，使pro溶解在溶液中② 乙醇 30% AKP 溶解状态 60% AKP 沉淀状态③ 丙酮 33% AKP 溶解状态 50% AKP 沉淀状态通过离心，去除部分杂蛋白通过离心，进一步去除杂蛋白④ 保护酶活性措施第13页/共35页低温条件下操作所有试管均需洗干净选择合适的pH及合适的缓冲体系，以稳定酶活性Mg(Ac)2 ~ NaAc 混合液提取AKPpH 8.8 Tris 缓冲液测AKP活性保护和稳定AKP 第14页/共35页三、操作步骤 2g新鲜兔肝剪碎→匀浆管 加 0.01M Mg(Ac)2- 0.01 M NaAc混合液2ml ，匀浆 匀浆液入离心管 用4ml上述混合液冲洗匀浆器，并倒 入离心管，混匀，记体积VA ?A液A1管 A2管 剩余A液0.1 ml A液 + 0.1 ml A液 +4.9 ml 0.01M pH 8.8 Tris 4.9 ml 生理盐水 加2ml正丁醇，搅拌3-5，室温放置30，过滤，入离心管（待测酶活性）（待测蛋白质含量）第15页/共35页 上述滤液 加等体积冷丙酮，混匀， 离心2000 rpm、5分钟上清入回收瓶 沉淀 加4.0 ml 0.5 M Mg(Ac)2, 搅拌，记体积VB ? B液B1管 B2管 剩余B液VB 0.10ml B 液 + 4.9 ml 0.01M pH 8.8 Tris 0.1 ml B液 +4.9 ml 生理盐水 加 VB 冷乙醇96%→ 30% ，混匀， 离心 2500 rpm ,5 分钟 （待测蛋白质含量）（待测酶活性）第16页/共35页上述离心结果上清 弃沉淀入离心管 ，记体积VB‘’，加 VB‘’冷乙醇 96%（30%→ 60% ） 混匀， 离心 2500 rpm ,5 分钟 上清入回收瓶 沉淀加 0.01M Mg(Ac)2- 0.01 M NaAc混合液4ml ，搅拌，记体积Vc? C液C1管 C2管 剩余C液Vc 0.10ml C 液 + 1.9 ml 0.01M pH 8.8 Tris 0.1 ml C液 +0.4 ml 生理盐水 加Vc冷丙酮→ 33% ，混匀,离心 2000 rpm ,5 分钟 （待测酶活性）（待测蛋白质含量）第17页/共35页上述离心结果上清 弃沉淀入离心管 ，记体积Vc,加1/3 Vc冷丙酮→ 50% ，混匀， 离心