章分子杂交技术.pptxVIP

会计学;一. 分子杂交种类 1. 按其分子种类划分 1） DNA杂交—探针为DNA或RNA 2） RNA杂交—探针为DNA或cDNA;2. 按样品制备过程划分 1） 原位杂交(in situ hybridization) i. 原位菌落杂交 ii. 原位噬菌斑杂交 iii. 原位细胞杂交 iv. 原位组织块杂交 原位裂解细胞，不需要分离DNA，RNA或蛋白质样品，可同时处理大量样品，常用于目的基因的筛选或检测某类细胞或组织中是否存在某一特定的DNA、RNA或蛋白质序列。; 3）转移杂交或印迹杂交(blotting hybridization) 先纯化样品，然后使不同大小的分子在凝胶上分离，转移到固体基质上，与探针杂交。该法可检测出感兴趣分子的分子量。用于转移的方法有： i. 扩散法 ii. 毛细管法 iii. 电泳转移法 iv. 真空转移法 4) 夹心杂交法(sandwich hybridization);3. 分子杂交的一般程序 1) DNA和RNA的杂交 制备DNA或RNA样品→与固定基质结合→80℃真空固定→预杂交→加入标记探针杂交→洗涤→放射自显影或显色反应。 2）蛋白质的免疫分析 制备蛋白质样品→与固定基质结合→常温空气中固定→封闭剂封闭→ 一抗反应→洗涤→二抗-酶偶联物反应→洗涤→显色反应（EIA） 或 → 一抗放射标记物→洗涤→放射自显影（RIA）;优点：i. 用于DNA，RNA杂交分析时结果可靠，灵敏，本底低。 ii. 用于蛋白质分析时，容量大（80μg/cm2)；可直接染色；分辨率高； 不需要预激活；易于操作 缺点： 结合低分子蛋白质不稳定，反复使用探针次数有限（2-3次） 2）重氮化纸：DBM纸与DPT纤维素纸 最大特点是能结合小分子的DNA，RNA和蛋白质，共价结合，可用不同探针进行多次杂交分析。该类基质结合生物大分子的能力差，需要激活，分析蛋白质时最好用放射性标记物。这类基质对生物大分子是主动吸附。 3) 尼龙膜 i. 阳离子尼龙膜（如Zeta-prob,Zeta-bind等）; i) 容量大, 蛋白质可结合480μg/cm2 ii) 可结合不同大小的DNA(6n.t.)，RNA和蛋白质。 iii) 韧性好 iv) 可用于电转移 v) 可进行反复多次杂交试验 vi) 广泛的化学耐受性和可高温消毒 *不能用于蛋白质的直接染色。 ii. 尼龙66 广泛用于核酸印迹分析，静电荷可从pH4时阳离子状态转变为pH7时阴离子状态，电转移时要注意。 4）离子膜 i. DEAE-纤维素纸(可用于ss-DNA, ds-DNA, RNA的制备回收) ii. CM-纤维素纸 (可用于碱性蛋白质的结合);2. 固定基质的选择依据 1）强度，耐久性，操作简便 2）高信噪比（低本底高信号） 3）生物大分子的结合容量和稳定性 4）重现性好 3. 各种杂交样品膜的制备 1）原位杂交样品膜的制备 i. 原位菌落杂交样品膜; i) 细胞培养（高密度，几百—十万个菌落或低密度，几百个以下） ii) 细菌细胞原位裂解与DNA变性 ii. 原位噬菌斑杂交样品膜 i) 细胞感染和噬菌斑形成（10,000-20,000/平板） ii) 噬菌体转移—用NCF作影印 iii) DNA变性与固定（与上同）;; ii. 毛细管法 (Capillary blotting method ) ;; v. 各种转移方法的比较 i) 扩散法和毛细管法：操作简便，不需要特殊转移仪器，但转移效率低,（扩散法为70%，毛细管法80%）耗时多。 ii) 电转移法：效率高，耗时少，需特殊转移仪，对转移条件要求较严。 iii) 真空转移法：效率高，耗时最少，需特殊真空转移仪。; ; 2) 非