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第二章 光学显微技术 第一页，共六十一页。第二章 光学显微技术光学显微镜的发展历程光学显微镜的成象原理光学显微镜的构造和光路图显微镜的重要光学参数样品制备第二页，共六十一页。1. 光学显微镜的发展历程15世纪中叶：眼镜片工匠们开始磨制放大镜。当时 的放大镜的放大倍数只有3—5x 1590年，荷兰的詹森父子(Hans and zachrias Janssen) 出第一台原始的、放大倍数约为20倍的显微镜。 16l0年，意大利物理学家伽利略(Galileo)制造了具有物镜、目镜及镜筒的复式显微镜。 1665年，英国物理学家罗伯特·胡克(Robert Hooke)用复式显微镜观察软木塞时发现了小的蜂房状结构，称为“细胞”，由此引起了细胞研究的热潮。 1684年，荷兰物理学家惠更斯(Huygens)设计并制造出双透镜目镜－惠更斯目镜，是现代多种目镜的原型。这时的光学显微镜已初具现代显微镜的基本结构。阿贝奠定了显微镜成像的古典理论基础，阐明光学显微镜成像原理。光学显微镜分辨本领达0.2?m理论极限。 1850年出现了偏光显微术； 1893年出现了干涉显微术； 1935年荷兰物理学家泽尔尼克创造了相衬显微术 第三页，共六十一页。1. 光学显微镜的发展历程在显微镜的发展史中，贡献最为卓著的是德国的物理学家、数学家和光学大师恩斯特·阿贝(Ernst Abbe)。他提出了显微镜的完善理论，阐明了成像原理、数值孔径等问题，在1870年发表了有关放大理论的重要文章。两年后．又发明了油浸物镜，并在光学玻璃、显微镜的设计和改进等方向取得了光辉的业绩。第四页，共六十一页。第五页，共六十一页。罗伯特·虎克制造的显微镜（1665）放大倍数：140倍 第六页，共六十一页。列文虎克和他的显微镜（约1680）第七页，共六十一页。第八页，共六十一页。第九页，共六十一页。第十页，共六十一页。第十一页，共六十一页。第十二页，共六十一页。第十三页，共六十一页。第十四页，共六十一页。2. 光学显微镜的成象原理2.1 衍射的形成2.2 阿贝成像原理第十五页，共六十一页。2.1 衍射的形成物理光学把光视为一种电磁波，具有波粒二象性，即波动性和粒子性。由于光具有波动性质，使得光波相互之间发生干涉作用，产生衍射现象。第十六页，共六十一页。第十七页，共六十一页。第十八页，共六十一页。第十九页，共六十一页。第二十页，共六十一页。圆孔衍射第二十一页，共六十一页。屏幕上的P1点到狭峰上边缘的距离和它到狭峰下边缘的距离之差为一个波长。从狭峰上缘和从狭峰下缘发出的两列光波在P1点相互增强，但这两列光波不过是从连线b上发出的无数光波中的一对，其他任意两列光波到达P1点的波程差均小于一个波长。整个狭峰内发出的光波的累计相干效果，是在P1点两侧造成一个光强的低谷，P1点位于谷底位置。相反，在P2点处，从狭缝上缘和下缘发出的光波的波程差1? 个波长，P2成为相干增强区的中心，称为第一级衍射极大值。第二十二页，共六十一页。衍射结果点光源经过光学仪器的小圆孔后，由于衍射的影响，所成的像不是一个点，而是一个明暗相间的衍射图样，中央为爱里斑。第二十三页，共六十一页。由斑点光源衍射形成的埃利斑（a）及其光强分布图（b）点光源通过透镜产生的埃利斑第一暗环半径 式中 n为介质折射率，λ照明光波长，α透镜孔径半角，M透镜放大倍数说明埃利斑半径与照明光源波长成正比，与透镜数值孔径成反比． 第二十四页，共六十一页。2.2 阿贝成像原理对于周期性结构的物体，图像的形成用阿贝成像原理来解释。光线通过细小的网孔时要发生衍射，衍射光线向各个方向传播，凡是光程差满足 k=0，1，2，…的，互相加强。同一方向的衍射光则成为平行光束。平行光束通过物镜在后焦面上会聚；形成衍射花样。衍射花样上的某个衍射斑点是由不同物点的同级衍射光相干加强形成的；同一物点上的光由于衍射分解，对许多衍射斑点有贡献。从同一物点发出的各级衍射光，在产生相应的衍射斑点后继续传播，在象平面上又相互干涉，形成物象第二十五页，共六十一页。阿贝成像原理阿贝成像原理可以简单地描述为两次干涉作用：平行光束受到有周期性特征物体的散射作用形成衍射谱，各级衍射波通过干涉重新在像平面上形成反映物的特征的像。第二十六页，共六十一页。物与象之间的相似性 物象是由直射光和衍射光互相干涉形成的，不让衍射光通过就不能成象，参与成象的衍射斑点愈多，则物象与物体的相似性愈好。第二十七页，共六十一页。放大原因显微镜和放大镜起着同样的作用，就是把近处的微小物体成一放大的像，以供人眼观察。只是显微镜比放大镜可以具有更高的放大率而已。 物体位于物镜前方，离开物镜的距离大于物镜的焦距，但小于两倍物镜焦距。所以，它经物镜以后，必然形成一个倒立的放大的实像AB。 AB靠近F2的位置上。再经目镜放大为虚